Получение рекомбинантных штаммов Aspregillus awamori - продуцентов ферментов для эффективной конверсии полисахаридов зернового сырья при производстве спирта

• Автор: Середа, Анна Сергеевна
• Шифр специальности: 05.18.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 210 с. : ил.

1. Литературный обзор

1.1 Технология производства пищевого спирта

1.2 Ферменты, участвующие в гидролизе зернового сырья при производстве спирта

1.3 Продуценты глюкоамилаз

1.4 Методы получения штаммовпродуцентов промышленных ферментов

2. Материалы и методы исследования

2.1 Штаммы грибов продуцентов глюкоамилазы

2.2 НГмутагенез и выделение i мутантов как реципиентов

для нлазмидной трансформации

2.3 Селекционные и ферментационные среды

2.4 Получение штаммовреципиентов . i

2.5 Плазмидные конструкции
2.6 Получение протопластов, трансформация и селекция
2.7 Условия облучения
2.8 Тесты на стабильность продукции глюкоамилазы
2.9 Определение активности ферментов
2. Анализ состава ферментных препаратов
2. Вискозимегрический метод определения общей эндодеполимеразной активности ксиланаз
2. Исследования по биокатализу некрахмальиых полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе рекомбинантных штаммов i i
2. Структу ра теорет ических и экспериментальных исследований
3. Результаты и их обсуждение
3.1 Выделение стабильного варианта штамма . i
3.2 Получение высокоэффективных штаммов . i продуцентов глюкоамилазы методом плазмидной трансформации
3.3 Получение высокоэффективных штаммов . i продуцентов ферментов, гидролизующих НПС и фитиевую кислоту методом плазмидной трансформации
3.4 Влияние индуктора на продуктивность рекомбинантных штаммов А. i
3.5 Поддержание коллекции рекомбинатных штаммов . i
3.6 Исследование биоконверсии некрахмальных полисахаридов зернового сусла комплексными ферментными препаратами, полученными на основе высокоэффективных рекомбинантных штаммов i i
3.7 Масштабирование процесса культивирования рекомбинантных штаммов i i в промышленных условиях
3.8 Испытания ферментного препарата глюкоамилазы в спиртовом производстве
3.9 Заключение
4. Выводы
5. Список литературы
Приложения
Список сокращений
АС амнлолитическя способность
АМФ аденозинмонофосфат
АДФ аденозиндифосфат
АТФ аденозинтрифосфат
БСА бычий сывороточный альбумин
ВКМ Всероссийская коллекция микроорганизмов
ВКПМ Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов
ГА глюкоамилаза
ГлА глюкоамилазная активность
ДЦСЭФ электрофорез в денатурирующих условиях
КЖ культуральная жидкость
КМЦ карбоксимегилцеллюлоза
КсА ксиланолитическа активность
МКЦ микрокристаллическая целлюлоза
рНАДФ Рникотинамидаденин динуклеотид фосфат
НГ нитрозометилгуанидин нитрозо гуанидин
НПС некрахмальные полисахариды
ПЭГ полиэтиленгликоль
РВ редуцирующие вещества
ОРВ остаточные редуцирующие вещества
РМ минимальная среда для выращивания посевного материала и селекции
штаммов . i
ПЦР полимеразная цепная реакция
СА сусло агаризованное
СП степень полимеризации
СВ сухие вещества
Т трансформант
ТОР агар верхний агар
УФ ультрафиолетовое излучение
ФП ферментный ные препарат ы
ЦМПМ Центральный музей промышленных микроорганизмов
ген, кодирующий фермент ацетамидазу
ату ген, кодирующий фермент амилазу
генактиватор амилолитических ферментов
агеЛ регуляторный г ен метаболитной репрессии азота
каталитический домен
СВМ углеводсвязывающнй домен
сгпА ген, кодирующий перенос аниона нитра т а
x ген кофактор молибдена
ген, кодирующий фермент глюкоамилазу
ген, кодирующий фермент глицеролфосфат дегидрогеназа
протопласта рующий буфер
микроорганизмы общепризнанные безопасными эндог.иоканаза
ген, кодирующий фермент гигромицип Б фосфо рансфсраза молекулярная масса
i гена кодирующий фермент нитратредуктаза i ген, дефектный по ферменту нитратредуктазе i ген индукции нитрата
грансформирующая плазмида с геном устойчивости к гигромицину В плазмида, содержащая ген активатор амилолитических ферментов
вектор, имеющий в своей структуре гомологичные нромоторную и терминагорную области глюкоамилазы . i плазмида, содержащая ген глюкоамилазы . i X плазмида, содержащая ген ксиланазы Р. сапесет
I плазмида, содержащая ген эндоглюканазы I Т. i v плазмида, содержащая ген фитазы . i полизтиленгликоль фитаза
трансформирующая плазмида с геном устойчивости к нитратредуктазе
ген, кодирующий фермент 5фосфооритпдиндекарбоксилаза
трансформационный буфер
трансформационный буфер
XI ингибитор ксиланаз ii iv
ген, кодирующий трехфункциональный фермент биосинтеза триптофана XI белок ингибитор ксиланаз Ху1 ксиланаза
Введение


Осахаривание заключается в обработке охлажденной разваренной массы ферментными препаратами для гидролиза полисахаридов и других веществ. Основным процессом при этом является ферментативный гидролиз образовавшихся из крахмала декстринов до сбраживаемых сахаров, мальтозы и глюкозы. В результате осахаривания получают полупродукт сусло спиртового производства. Для осахаривания разваренную массу охлаждают до С и выдерживают с микробными ферментными препаратами в течение минут. В процессе осахаривания используются препараты глюкоамилазы 6 едг крахмала . Основную часть полученного после осахаривания сусла охлаждают до С и направляют в батарею для сбраживания, а часть неохлажденного сусла при температуре осахаривания перекачивают в дрожжанки для приготовления засевных дрожжей и в возбраживатель для выращивания производственных дрожжей. В технологии влажного помола, полученная в результате брожения дрожжевая биомасса, сепарируется и возвращается обратно в ферментер для поддержания высокой концентрации клеток в исходном сусле. Полученная зрелая бражка, освобожденная от дрожжевой массы и содержащая около об. Но завершении процесса ректификации получается пищевой спирт крепостью . Тепловая и ферментативная обработка замеса 3 часа при С с добавлением термостабильной аамилазы 1, сд. АС на 1 г уел. ГлЛ на I г уел. ФП протеаз и ФП, гидролизующих НПС добавление аамилазы 1, ед. АС на 1 г уел. С в течение мин добавление термостабильной аамилазы 1, сд. АС на 1 г уел. С в течение мин мин при С с добавлением термостабильной аамилазы 2 ед. АС на 1 г уел. Замес отбирается, подастся в подогреватель, где подогревается экстрапаром, до температуры С в предразварнике мни при Т с добавлением термостабильной аамилазы 1 ед. АС на 1 г уел. С с добавлением термостабильной аамилазы 1 ед. АС на 1 г уел. Осахариванис в осахаривателе мин при Сс добавлением глюкоамилазы 6,,5 ед. ГлА на 1 г уел. Сс добавлением глюкоамилазы 6,,5 ед. ГлА на 1 г уел. Сс добавлением глюкоамилазы 6,,5 ед. ГлА на 1 г уел. Сс добавлением глюкоамилазы 6,,5 ед. ГлА на 1 г уел. Зерно различных злаков состоит из трех основных частей зародыша, эндосперма и оболочек рис. Снаружи зерно покрыто плодовой оболочкой, которая прилегает непосредственно к семенной. Плодовая оболочка четырехслойная. Семенная оболочка двухслойная. Далее следует алейроновый слой, содержащий главным образом белки и жиры. Алейроновый слой охватывает мучнистую часть зерна эндосперм. Эндосперм представлен гонкостенными крупными клетками, часто неправильной формы, заполненными крахмалом и белками. Белки образуют сплошную матрицу, в которую вкраплены крахмальные гранулы разных размеров. По мере удаления от центра размер клеток уменьшается, соответственно снижается доля крахмала, а количество белка увеличивается. Зародыш находится в нижней части зерна и отделен от эндосперма щитком. Наибольший удельный вес в зерне занимают углеводы, которые представлены в основном крахмалом. Он находится в клетках в виде зерен. Углеводная часть крахмальных зерен состоит из двух полисахаридов амилозы и амилопектина 5. Клеточные стенки зерна состоят из некрахмальиых полисахаридов. Гемицеллюлозы составляют главную часть клеточных оболочек. Они являются связующим звеном между целлюлозой и крахмалом. В небольших количествах в клеточных стенках находятся и пектины 5. Важной составной частью семян злаковых являются белковые вещества. Основная часть белков проламийны и глютелииы. Кроме того, в состав белков входя г альбумины и глобулины, которые содержат все незаменимые аминокислоты. Содержание липидов в злаковых колеблется в среднем от 2 до 3 5. Простые липиды находятся в зародыше и являются запасными веществами, которые используются при прорастании. Сложные липиды входят в состав мембран оболочек клеток и принимают участие в клеточных процессах. В злаковых содержатся водо и жирорастворимые витамины каротиноиды, витамин Е, витамины группы В тиамин, рибофлавин, паитотеновая кислота, пироксин, ниацин и др 5. Доля минеральных элементов 1,. Зерно является источником многих микроэлементов цинка, марганца, молибдена, кобальта и др 5.