Биохимическая характеристика хрящевой ткани гидробионтов и технология БАД к пище

• Автор: Суховерхова, Галина Юрьевна
• Шифр специальности: 05.18.07, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 157 с. : ил.

1. Обзор литературы

1.1. Характеристика хрящевой ткани животных

1.1.1. Гликозаминогликаны: хондроитинсульфаты, гиалуроновая кислота

1.1.2. Коллаген

1.1.3. Белки неколлагеновой природы

1.1.4. Другие компоненты хрящевого матрикса: коллагеназы, тканевые ингибиторы металлопротеиназ матрикса

1.2. Биологическая активность компонентов, входящих в состав хрящевой ткани

1.3. Известные способы использования хрящевой и костно-хрящевой ткани сельскохозяйственных животных и рыб для получения биологически активных веществ, обладающих хондропротекторными свойствами

2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы исследований

2.2. Методы исследований

2.2.1. Метод определения протеолитической активности ферментов
2.2.2. Метод определения коллагенолитической активности ферментов
2.2.3. Количественное определение гексозаминов
2.2.4. Количественное определение гиалуроновой кислоты
2.2.5. Количественное определение хондроитинсульфатов
2.2.6. Метод определения гексоз
2.2.7. Определение содержания свободных гексозаминов
2.2.8. Определение содержания коллагена
2.2.9. Определение неколлагеновых белков
2.2.10. Определение фракционного состава ферментативных гидролизатов
из хрящевой ткани гидробионтов методом ВЭЖХ
2.2.11. Метод определения ингибиторной активности ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов на казеинолитическую, коллагенолитическую активности ферментов
2.2.12. Определение качественного состава свободных дисахаридов методом капиллярного электрофореза
2.2.13. Определение состава аминокислот
2.2.14. Определение содержания белковых компонентов
2.2.15. Метод определения накопления растворимых белковых компонентов
2.2.16. Определение острой токсичности ферментативного гидролизата
2.2.17. Исследование противовоспалительной активности ферментативного гидролизата из хрящевой ткани на животных
2.2.18. Клинические испытания БАД к пище «Артротин» из хрящевой

ткани гидробионтов при полиостеоартрозе
2.2.19. Статистическая обработка результатов
3. Результаты и обсуждение
3.1. Обоснование выбора сырья
3.1.1. Размерно-массовая характеристика сырья
3.1.2. Химический состав хрящесодержащего сырья и хрящевой ткани гидробионтов
3.1.3. Массовая доля хрящевой ткани и содержание гексозаминов
в источниках сырья
3.1.4. Исследование антипротеазной активности компонентов хрящевой ткани, полученных разными способами
3.1.5. Классификация источников сырья, содержащих хрящевую ткань гидробионтов, для получения биологически активных компонентов
3.2. Подбор условий деполимеризации протеогликановых комплексов хрящевой ткани гидробионтов
3.2.1. Предварительная обработка хрящевой ткани
3.2.2. Обоснование параметров ферментативного гидролиза протеог-ликанового комплекса хрящевой ткани
3.3. Состав ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов
3.3.1. Количественное содержание гексозаминов, хондроитинсульфа-тов, гиалуроновой кислоты, гексоз, коллагена и неколлагеновых белков
3.3.2. Фракционный состав ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов
3.3.3.Исследование состава свободных дисахаридов
3.3.4. Аминокислотный состав
3.3.5. Минеральный состав
3.4. Антипротеазная активность ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов
3.5. Технология биологически активной добавки к пище из хрящевой
ткани гидробионтов
3.6. Оценка безопасности и исследование биологической активности БАД
к пище «Артротин»
3.7.Технико-экономические показатели промышленного производства
БАД к п и ще «Артроти н»
Выводы
Список литературы
Приложения

Актуальность проблемы. Работы по поиску, выделению и испытанию биологической активности компонентов хрящевой ткани сельскохозяйственных животных и некоторых акул известны с 1950-х годов (Prudden, 1957; Folkman, 1963,1976; Langer, Brem, 1976; Lee, Langer, 1983; Cho, Kirn, 2002).
Основными компонентами хрящевой ткани животных являются гликозаминогликаны, такие как хондроитинсульфаты, дерматансульфаты, гиалуроновая кислота, которые вместе с коллагеном II типа образуют сложный протеогликановый комплекс (Слуцкий, 1969; Павлова, 1988).
Имеются многочисленные сведения о влиянии гликозаминогликанов и гексозаминов, являющихся предшественниками макромолекул суставного хряща, на метаболизм и регенерацию хрящевой ткани за счет использования «готового строительного материала» и способности накапливаться в очагах воспаления (Серов, Шехтер, 1981; Игнатова, Гуров, 1990; Palmieri et al„ 1990; Алексеева и др., 1995; Данилевская, Николаев, 2002; Руденко, 2005). Активность гликозаминогликанов определяется количеством функциональных групп в молекуле, обеспечивающих высокую гидрофильность и поверхностно-активные свойства (Шитов, 1992). Количественно преобладающим белком протеогликанового комплекса хрящевой ткани является коллаген, который не только выполняет механические функции, но играет важную роль в дифференциации и пролиферации клеток, что определяет применение этого белка и его растворимых производных при остеопорозе (Пат. РФ 2082416; Пат. WO 9605851; Пат. US 6025327), артритах (Пат. US 5856446; заявка № WO 98/44929). Важную роль в метаболизме хрящевого соединительнотканного матрикса играют тканевые ингибиторы металлопро-теиназ (ТИМП), подавляющие активность эндогенных коллагенолитических ферментов (КФ 3.4.24) - инициаторов воспалительных процессов и деполимеризации хрящевой ткани (Риггз, 2000; Хасигов, 2001; Tryggvason et al., 1987; Fosang et al., 1996; Stracke et al., 2000).

Идентификацию и количественное определение углеводных компонентов, содержащих хондроитинсульфаты, в пробах осуществляли путем калибровки относительно имеющихся стандартов. В качестве стандартов гликозаминогликанов использовали коммерческие препараты хондроитинсульфатов А (ХС А), С (ХС С), D (ХС D) и А из осетра (ХС А-1), гиалуроновую кислоту и в качестве стандарта мономера гликозаминогликановой цепи - глюкозамингидрохлорид (ICN, США).
Молекулярную массу и молекулярно-массовое распределение компонентов в пробах рассчитывали с помощью программно-аппаратного комплекса для сбора и обработки хроматографических данных МультиХром (версия 1.6).
2.2.11. Метод определения ингибиторной активности ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов на казеинолитическую и коллагенолитическую активности ферментов
Влияние препаратов на активность ферментов определяли по изменению коллагенолитической и казеинолитической активностей (метод определения приведен ранее) в указанных выше ферментных препаратах при инкубации в присутствии различных концентраций ферментативных гидролизатов хрящевой ткани через определенные промежутки времени. Для определения ингибиторной активности гидролизатов и сублимированного хряща использовали смеси растворов фермента и исследуемого препарата в соотношениях 1 : 0.1; 1 : 0.25; 1 : 0.5; 1 :1; 1 : 5; 1 : 8; 1:10. Смесь растворов выдерживали в течение 30, 60,120 мин при температуре 4 °С.
Степень ингибирования препаратов выражали в % от исходной активности ферментов принятой за 100 %.
2.2.12. Определение качественного состава свободных дисахаридов
методом капиллярного электрофореза
Условия разделения подобраны авторами (Karamanos et al., 1995) и основаны на способности отрицательно заряженных дисахаридов