Влияние гена Trithorax-like на формирование глаза Drosophila melanogaster

• Автор: Баттулина, Надежда Викторовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава Г ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ЕЕ Структура глаза дрозофилы
Е2. Развитие глаза дрозофилы
Е2.Е Формирование и продвижение морфогенетической бороздки
1.2.2. Дифференцировка клеток омматидия
1.2.2.1. Индуктивные взаимодействия, обеспечивающие последовательную дифференцировку клеток омматидия
1.2.2.2. Гены, требующиеся для дифференцировки клеток омматидия
1.3. Молекулярно-генетическая характеристика гена lozenge D. melanogaster
1.3.1. Гены-мишени белка Lz, участвующие в развитии глаза дрозофилы
1.3.2. Фенотипическое проявление мутаций гена lz
1.3.3. Регуляция экспрессии гена lz
1.4. Молекулярно-генетическая характеристика гена Trithorax-like {Tri)
1.4.1. Структура гена Tri
1.4.2. Транскрипция гена Tri
1.4.3. Структура белка GAGA, продукта гена Tri
1.4.4. Функции белка GAG А
1.4.4.1. Участие белка GAGA в ремоделировании структуры хроматина
1.4.4.2. Участие белка GAGA в активации транскрипции
1.4.4.3. Участие белка GAGA в подавлении активности генов
1.4.4.4. Белок GAGA требуется для функционирования инсуляторов
1.4.5. Белковые взаимодействия GAGA-фактора ;
1.4.6. Участие белка GAGA в процессе формировании глаза дрозофилы
Заключение

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2Л. Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе, и условия их

разведения
2.2. Выделение ДНК
2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.4. Олигонуклеотиды

2.5. Секвенирование с использованием набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator Ready Mix
2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.7. Набор материала для выделения РНК
2.8. Выделение РНК
2.9. Получение 32Р-меченых ДНК-зондов
2.10. Нозерн-блот-гибридизация
2.11. ПЦР с использованием обратной транскрипции (ОТ-ПЦР)
2.12. Вестерн-блот-анализ
2.13. Метод задержки ДНК-пробы в геле
2.14. Иммунохимическое окрашивание имагинальных дисков
2.15. Приготовление полутонких срезов глаз дрозофилы
2.16. Микроскопический анализ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Молекулярная и цитогенетическая характеристика мутации Trlen82
3.2. Анализ экспрессии гена Ы в глазо-антеннальных имагинальных дисках и мозговентральных ганглиях предкуколок дрозофилы
3.3. Анализ нарушений структуры глаза у 7>/-мутантов
3.3.1. Анализ поверхности глаза

3.3.2. Анализ полутонких срезов глаз имаго дрозофилы
3.3.3. Анализ глазо-антеннальных имагинальных дисков Гг/-мутантов
3.4. Взаимодействие генов Trithorax-like и lozenge
т tsl fp 7 362 / 'т'. 1R85 1 tsl. tv 7 еп82 / i R85 'п о
3.4.1. Анализ поверхности глаз мутантов Zz ;7W ITrl и/z Jri fin /о
7 V j-tsl,rp 1362/гг, 1R85
3.4.2. Анализ срезов глаз имаго мутантов lz и «двойных» мутантов /г ,lrl ПН
и lz tsI;Trl en82/TrlR8S
3.4.3. Анализ структуры глазо-антеннальных имагинальных дисков мутантов lzts и
1 tsl пп 1362/rp j R85 1 tsl. ji 1 en82ц* jR85 RA
«двойных» мутантов lz ;Trl ITrl и lz ,lrl ПН
3.5. Генетическое взаимодействие генов Tri тл. Bar Hl
3.6. Анализ связывания рекомбинантного белка GAGA с последовательностями из 5 -областей генов lz, Bar Hl и ВагН2
3.7. Анализ экспрессии гена lz у мутантов Trl362/TrlRS5 и Trlen82/TrlK85
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Мутации гена Tri приводят к нарушению структуры омматидиев и организации глаза дрозофилы
4.2. Взаимодействие генов Trithorax-like и lozenge
4.2.1. Снижение белка Lozenge у Гг/-мутантов
4.3. Нарушения в структуре глаз Гг/-мутантов
4.3.1. Причины нарушения количества и распределения конусных клеток у Trl-
мутантов
4.3.2. Причины нарушения количества фотонейронов у Гг/-мутантов
4.3.3. Особенности формирования рабдомера фотонейрона R7 у мутантов по генам Tri

и 1г
4.3.4. Причины нарушения количества пигментных клеток у Гг/-мутантов
4.3.5. Недостаток щетинок вокруг омматидиев Гг/-мутантов
4.3.6. Причины нарушения ориентации омматидиев у Гг/-мутантов
4.3.7. Причины нарушения четкости рядов из омматидиев у Гг/-мутантов
Заключение
ВЫВОДЫ

выявлено, что в дифференцированных клетках глазного диска происходит увеличение уровня экспрессии гена lz. Ряд фактов свидетельствует в пользу того, что в недифференцированных клетках данный ген находиться под негативным контролем белка Yan (ядерного эффектора Rasl/MAPK-сигнального пути), способного связываться с последовательностью глазо-специфичного энхансера гена lz (Behan et al., 2002). Однако показано, что сайты связывания белка Yan в гене lz находятся за пределами минимального глазо-специфичного энхансера (Canon, Banerjee, 2003).
1.4. Молекулярно-генетическая характеристика гена Trithorax-like (Tri)
Ген Trithorax-like (Tri) расположен в ЗЬ-хромосоме D. melanogaster, в районе 70F1—2 (Farkas et al., 1994). Данный ген кодирует многофункциональный белок GAGA (Soeller et. al, 1993), участвующий в регуляции транскрипции и функционировании различных регуляторных элементов.
1.4.1. Структура гена Tri
Ген Tri представлен в геноме единичной копией (Soeller et al., 1993) и имеет 7 экзонов (рис. 5) (Катохин и др., 2001). Экзоны 2, 3 и 4 идентичны во всех проанализированных кДНК, а 5’- и З’-концы мРНК формируются за счет альтернативного сплайсинга. Существует 4 варианта первого экзона: la, lb, 1с и Id. Первый экзон гена Tri не является белок-кодирующим. Во втором экзоне заканчивается некодирующая лидерная последовательность всех изученных транскриптов, и с позиции 3853 п.н. начинается кодирующая часть гена (здесь и далее координаты нуклеотидов даны в соответствии с последовательностью GenBank #AJ225042). Экзоны 5 и 6 представлены двумя вариантами: короткими (5а и 6а) и длинными (5Ь и 6Ь). Экзон 6а был выявлен только в комбинации с экзонами 5Ь и 7. Экзон 6Ь имеет на конце сайт полиаденилирования и был выявлен в комбинации с экзонами 5 а или 5Ь. Экзон 7 также заканчивается сайтом полиаденилирования и был найден только в одном транскрипте (Benyajati et al., 1997; Катохин и др., 2001).
При анализе структуры открытых рамок считывания все транскрипты были разделены на две основные группы (рис. 5). К первой группе относятся транскрипты, которые содержат экзоны 2, 3, 4 и 5Ь, и кодируют изоформу белка размером 519 а.к.