Применение ISSR-PCR маркеров для изучения внутривидового генетического полиморфизма сосны обыкновенной на объектах единого генетико-селекционного комплекса

• Автор: Новиков, Петр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 120 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

I. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Развитие молекулярно-генетических методов исследования

видов Pinus L

1.2. Основные направления исследований растений рода

Pinus L. с применением молекулярно-генетических маркеров

1.3. Исследования в популяционной биологии сосны обыкновенной {Pinus sylvestris L.) на территории СНГ

И. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Сбор и хранение образцов для анализа

2.3. Выделение геномной ДНК растений для ПЦР анализа
2.4. Полимеразная цепная реакция
2.5. Электрофорез продуктов амплификации
2.6. Визуализация и математическая обработка данных ПЦР-анализа
2.7. Объем исследований
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Оптимизация методики IS SR-анализа для оценки
генетического полиморфизма сосны обыкновенной
3.1.1. Выбор оптимального метода разрушения клеточных структур
3.1.2 Подбор ISSR-праймеров для анализа генетического полиморфизма сосны обыкновенной
3.1.3 Разработка программного модуля Bioimage Geles PCR
Analysis v.l.О
3.4 КЗЯ-анализ выборок сосны обыкновенной различных
селекционных категорий
3.5. КБЯ-анализ плюсовых деревьев сосны обыкновенной
из различных географических районов
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Генетические ресурсы основных лесообразующих пород к настоящему времени на территории бывшего СССР исследованы достаточно детально (Крутовский и др., 1989; Путенихин, 2000; Гончаренко, 2001; Падутов, 2001; Потенко, 2004; Политов, 2007 и др.). Однако изучению генетических ресурсов искусственных насаждений посвящено гораздо меньше исследований (Шигапов и др., 1996; Авров, 2001; Коршиков и др., 2010). К тому же основная часть этих работ выполнена с применением в качестве маркеров изоферментов, имеющих ряд методологических и методических ограничений (Сулимова, 2004). Современные генетические маркеры и методы в популяционно-генетических исследованиях древесных растений в России (по сравнению с зарубежными странами) применяются крайне редко (Семериков, 2007; Боронникова, 2009; Bushbom et al., 2011).
Сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.) - один из наиболее широко распространенных экономически важных лесообразующих видов России, играющий исключительно важную роль в формировании структуры и функций лесных экосистем (Тараканов, 2003). В европейской части России более 65 % работ по созданию объектов единого генетико-селекционного комплекса (ЕГСК) приходится на сосну обыкновенную (Прохорова и др., 2008; Ефимов, 2010). Традиционными в лесной генетике и селекции являются пути, основанные на изучении географических культур и использовании плюсовой селекции (Видякин, 2008). Однако они не учитывают исторически сложившуюся генетическую структуру природных популяций древесных видов и необходимость сохранения и воспроизводства генетических ресурсов в условиях ex situ (Политов, 2007). По этой причине генетические исследования объектов ЕГСК, основанные на применении современных эффективных методов генетического анализа и сравнении полученных оценок с генофондом природных популяций, представляются актуальными. Они позволят оценить эффективность селекционных и

1. Образец помещали в пробирку 2,0 мл с круглым дном вместе с тремя стерильными металлическими шариками. Пробирки нумеровали в соответствии с вложенными образцами.
2. Пробирки помещали в гомогенизатор для пробоподготовки SpeedMill Plus (Analytik Jena AG, Германия) и гомогенизировали в течение 30 минут в случае использования хвои и в течение 2,5-3 часов в случае использования древесины.
3. Необходимый объем 2*СТАВ (2% СТАВ, 1,4 М хлорида натрия,
20мМ ЭДТА, 100 мМ трис-HCl (рН=8,0), 1% поливинилпиролидол)
экстрагирующего буфера нагревали до 65°С, предварительно добавив 0,2% ß-mercaptoethanol (добавляется непосредственно перед использованием).
4. После измельчения растительного материала металлические шарики вынимали и добавляли 1000 мл 2 х СТАВ -экстрагирующего буфера и перемешивали.
5. Инкубировали пробирки при температуре 65°С в течение 60 минут при мягком перемешивании в термомиксере.
6. Пробирки охлаждали до комнатной температуры.
7. Добавляли 200 мкл «wet» хлороформа (24:1 хлороформ и изоамиловый спирт.). Мягко перемешивали до однородной фазы.
8. Центрифугировали 3 минуты при 15000 оборотов в минуту.
9. Переносили верхнюю фазу в чистую пробирку.
10. Повторяли шаги 7, 8 и 9 для лучшей очистки экстракта от механических тканей и протеинов.
11. Добавляли 600 мкл охлажденного (-20°С) изопропанола, мягко перемешивали для осаждения СТАВ-нуклеинового комплекса.
12. Ставили смесь в морозильную камеру (-20°С) на 60 минут.
13. Клубок СТАВ-нуклеинового комплекса осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 15000 об/мин.
14. Осторожно, чтобы не выпал осадок ДНК, сливали супернатант.