Создание бактериальной тест-системы для скрининга ингибиторов протеинкиназ на основе генов фосфотрансфераз

• Автор: Беккер, Ольга Борисовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 166 с. : ил.

Содержание.
Список сокращений
Введение
Глава 1.
Протеин киназы
1.1. Характеристика некоторых серин/треониновых протеинкиназ человека и бактерий
1.1.1. Функции некоторых серин/треониновых протеинкиназ человека
1.1.2. Функции некоторых бактериальных серин/треониновых протеинкиназ
1.2. Классификация прокариотических протеинкиназ, осуществленная
для выяснения потенциальной биологической активности киназ
1.3. Структура серин/треониновых протеинкиназ эукариотического типа
1.4. Ингибиторы протеинкиназ
1.5. Классификация прокариотических протеинкиназ, основанная на селективных профилях ингибиторов протеинкиназ
1.6. Серин/треониновые протеинкиназы Streptomyces coelicolor
1.7. Клонирование и гетерологичная экспрессия генов
серин/треониновых-протеинкиназ Streptomyces в клетках E.coli
1.8. Кальций-зависимые серин/треониновые протеинкиназы Streptomyces
1.9. Области взаимодействия с ионами кальция у кальций-связывающих
белков бактерий
Глава 2. Бактериальные аминогликозидфосфотрансферазы (aph)
2.1. Механизм действия аминогликозидфосфотрансфераз
2.2. Структура аминогликозидфосфотрансфераз
2.3.Характеристика аминогликозидфосфотрансферазы aphVHI
Streptomyces rimosus
Глава 3. Биологические тест-системы
Глава 4. Материалы и методы

4.1. Бактериальные штаммы, среды, антибиотики, модуляторы активности СТГЖ
4.2. Праймеры, использованные в работе
4.3 Процедуры молекулярного клонирования и амплификации
4.4. Электрофорез в полиакриламидном геле (SDS-PAGE)
4.5. Получение экстрактов клеток Streptomyces и E. coli
4.6. Афинное выделение протеинкиназ
4.7. Очистка белка aphVIII в нативном виде
4.8. Анализ фосфорилирования белка aphVIII in vitro
4.9. Фосфоаминокислотный анализ
4.10. Анализ протеинкиназ в геле
4.11. Выделение клонированного в E. coli каталитического домена протеинкиназы рк2
4.12. Анализ аутофосфорилирования выделенного белка каталитического домена рк
4.13. Процедура клонирования в экспрессионные вектора рЕТ32а, рЕТ22Ь и рЕТ 16Ь и конструирование рекомбинантных плазмид
4.14. Процедура сайт-направленного мутагенеза области Ser-146 аминогликозидфосфотрансферазы aphVIII
4.15. Определение уровня устойчивости к канамицину трансформантов E.coliBL21(DE3), содержащих гены aphVIII ирк
4.16. Методика определения активности ингибиторов протеинкиназ в
бактериальной тест-системе
Глава 5. Результаты и обсуждение
5.1 Характеристика аминогликозидфосфотрансферазы VIII (aphVIII)
5.2. Характеристика серин/треониновой протеинкиназы рк25 в S.
lividans ТК24(66) и S. coelicolor А3(2)
5.2.1. Идентификации протеинкиназы, фосфорилирующей белок aphVIII в штамме S. lividans aph VIII+

5.2.2. Клонирование и экспрессия нуклеотидной последовательности каталитического домена протеинкиназы рк25 штамма S.coelicolor A3(2) в клетки E. coli в экспрессионном векторе рЕТ22Ь
5.2.3. Анализ аутофосфорилирования в активационной петле каталитического домена протеинкиназы рк25
5.3. Тест-система S. lividans ТК24 (66) aphVIII+lCTIIK
5.3. 1. Механизм действия тест-системы
5.3.2. Валидация тест-системы S. lividans ТК 24 (66) aphVIU+ICTIIK ^g
5.3.3. Скрининг потенциальных ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ человека и бактерий
5.4. Конструирование тест-системы E.coli aphVUI/pk 25
5.4.1. Модификация области S-146 аминогликозидфосфотрансферазы aphVIII - сайта фосфорилирования киназой рк
5.4.2. Создание конструкции, содержащей гены aphVIII и протеинкиназы рк
5.4.3. Анализ уровня устойчивости к канамицину клеток E. coli BL21 (DE3), содержащей различные модификации гена aphVIII и их комбинации с геном рк
5.5. Выбор и валидация тест-системы E. coli aphVIII/pk
5.6. Потенциальные возможности использования тест-системы E. coli
aphVIII146- 1/рк25 для скрининга ингибиторов СТПК
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Заключение
Выводы
Список литературы

purines
oxoindoles

C0K2:1ke
CDK2; 1ke
CDK2; 1ke7 СОК2; 1ке
r)0-;J^
СОК2, 1ке

CDK2; 1fvv
«^Ч>Ь
CDK2; 1fvt

FGFR1; 1lgl

&”$=e
C0K2; 1e9ti
>40to

HGFK1; 1agw

MAPK1;4erk
,
LPHB2; ')РЭ
Xprxp

CDK2: 1 Ms

CDK2; lillr
Cr'o:>
CDK2; 1h1q

CDK2; 1h1p
0~'V*yn'33'

CDK2: 1g5s
"^rxr“
CDK2; Ickp
Рисунок 4b. Протеинкиназные ингибиторы различных химических классов (пурины, оксииндолы).