Разработка методов ПЦР для выявления вируса гриппа птиц подтипов H3, H4, H5 и изучение биологических свойств изолятов вируса

• Автор: Бабин, Юрий Юрьевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 138 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВГ - вирус гриппа
ВГП - вирус гриппа птиц
ВГП/А - вирус гриппа птиц типа А
ВНБ - вирус ньюкаслской болезни
ВИГИ - высокопатогенный грипп птиц
ГП - грипп птиц
ГТФ - гуанозинтрифосфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА - иммуноферментный анализ
кДНК - ДНК-копия с РНК матрицы
КЭ - куриный эмбрион
МЭБ - всемирная организация охраны здоровья животных н. п. - нуклеотидные пары ОТ - обратная транскрипция ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
ОТ-дПЦР-РВ - обратная транскрипция полимеразная цепная реакция в
режиме реального времени в формате дуплекс
РГА - реакция гемагглютинации
РДП - реакция диффузионной преципитации
РНП — рибонуклеопротеин
РТНА - реакция торможения нейраминидазной активности
РНК - рибонуклеиновая кислота
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
нпгп - низкопатогенный грипп птиц
ФБР - фосфатно-буферный раствор
ЦПД - цитопатическое действие
ЭЭЖ - экстраэмбриональная жидкость
НА - гемагглютинин

МБСК - культура клеток почки собаки 1УР1 - внутривенный индекс патогенности КА - нейраминидаза
КУБЬ - Национальная ветеринарная лаборатория, г. Эймс, США

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Историческая справка
1.2. Классификация и номенклатура вируса гриппа
1.3. Строение вируса гриппа
1.4. Цикл репликации вируса гриппа
1.5. Молекулярные детерминанты патогенности, вирулентности и ограничения круга хозяев
1.5.1. Гемагглютинин
1.5.2. Белок РВ2
1.5.3. Белок N81
1.5.4. Белок РВ1-Б2
1.6. Распространение вируса гриппа в популяциях диких птиц
1.7. Инфицирование млекопитающих вирусом гриппа птиц
1.8. Инфицирование рептилий и земноводных вирусом гриппа птиц
1.9. Молекулярно-генетические методы в диагностике вируса гриппа птиц
1.9.1. Применение ОТ-ПЦР в диагностике вируса гриппа птиц
1.9.2. Применение ОТ-ПЦР-РВ в диагностике вируса гриппа птиц
1.9.3. Применение мультиплекс-ПЦР в диагностике вируса гриппа птиц
1.9.4. Применение ДНК-биочипов в диагностике вируса гриппа птиц
1.10. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Вирусы
2.1.2. Куриные эмбрионы
2.1.3. Лабораторные животные
2.1.4. Праймеры
2.1.5. Растворы и буферные смеси
2.1.6. Ферменты

Определение первичной нуклеотидной последовательности фрагментов гена НА ВГП осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США) согласно инструкции производителя.
2.2.7. Компьютерный анализ и сравнение первичной нуклеотидной последовательности фрагмента гена НА. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы BioEdit, версия 7.0. Для сравнения полных последовательностей гена НА были использованы последовательности гена НА штаммов ВГП, полученные из международной базы данных GenBank

последовательностей наиболее близких к последовательностям изучаемых изолятов пользовались ресурсом Megablast NCBI

2.2.8. Выделение и культивирование вируса гриппа птиц в куриных эмбрионах. Из исследуемого биологического материала (экстраэмбриональная жидкость, клоакальные и ротоглоточные смывы, пробы трахей, легких, головного мозга, селезенки и кишечника) готовили 10%-ную суспензию на стерильном ФБР и центрифугировали в течение 15 мин. при 1000g. К надосадочной жидкости добавляли антибиотики: пенициллин (2000 ед/мл), стрептомицин (2мг/мл), гентамицин (50 мкг/мл) и микостатин (1000 ед/мл); инкубировали при температуре 20°С в течение 60 мин и использовали для инокуляции эмбрионов СПФ-кур.
Перед заражением эмбрионы овоскопировали и отбирали пригодные для вирусологических работ, с хорошо развитой сосудистой системой. Отмечали место введения суспензии, которое выбирали в бессосудистых участках на 3