Разработка средств детекции высоковирулентного штамма вируса гриппа A подтипа H5N1

• Автор: Аканина, Дарья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список использованных сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Описание заболевания

2.2. Общая характеристика вируса гриппа

2.3. Эпидемиология вируса гриппа А подтипа H5N

Передача вируса

Клинические проявления

Патогенез

2.4. Способы детекции вируса гриппа и антител к нему

2.4.3. Иммуноферментный анализ
2.4.4. Молекулярные методы
2.4.4.1. Полимеразная цепная реакция
2.4.4.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Методы
4. Результаты
4.1. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР
4.1.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР
4.1.2. Определение специфичности ПЦР тест-системы
4.1.3. Определение чувствительности ПЦР тест-системы
4.1.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для ПЦР тест-системы
4.2. Разработка тест-системы для обнаружения вируса гриппа А подтипа H5N1 методом ПЦР в реальном времени
4.2.1. Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР
4.2.2. Определение специфичности тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
4.2.3. Определение чувствительности разработанной тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
4.2.4. Конструирование генно-инженерного положительного контроля для тест-системы на основе ПЦР в реальном времени
4.3. Разработка теста для количественного определения вируса гриппа А подтипа H5N
4.3.1. Использование количественного теста для определения накопления рекомбинантного вируса гриппа А/ H5N1, полученного методом обратной генетики
4.4. Участие в международной интеркалибрации WHO External Quality Assessment Programm (EQAP)

4.5. Использование разработанных тест-систем для выявления вируса гриппа А подтипа H5N
4.6. Разработка тест-системы на основе непрямого ИФА для обнаружения антител к неструктурному белку вируса гриппа NS
4.6.1. Создание рекомбинантного белка NS1 вируса гриппа
4.6.2. Проведение непрямого ИФА с рекомбинантным белком NS1
5. Обсуждение результатов
6. Выводы
7. Библиография
8. Приложения

Список использованных сокращений
ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота ИФА - иммуноферментный анализ НА - гемагглютинин NA - нейраминидаза КЭ - куриные эмбрионы АГ - антиген
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота РСК - реакция связывания комплемента РТГА - реакция торможения гемагглютинации ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дНТФ - дезоксинуклеотидтрифосфат
ОТ/ПЦР - полимеразная цепная реакция с предшествующей реакцией обратной транскрипции
ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени
кДНК - комплементарная дезиксирибонуклеиновая кислота
ЕФ - европейская фармакопея
ФСП - фармакопейная статья предприятия
СТО - стандарт организации
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭИД - эмбриональная инфекционная доза
п.н. - пара нуклеотидов
ПААГ - полиакриламидный гель
мАТ - моноклональные антитела
ВЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ЯМР - ядерный магнитный резонанс
ВОЗ - всемирная организация здравоохранения
WHO - world health organization (всемирная организация здравоохранения)

На рисунке 4 представлены компоненты, необходимые для проведения ПЦР на матрице РНК (например, вируса гриппа).
1. ДНК-матрица - ДНК или кДНК, содержащая специфический фрагмент с местами посыдки праймеров;
2. Праймеры -олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидных пар), комплементарные последовательностям ДНК или кДНК на границах определяемого специфического фрагмента. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа.
3. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - смесь четырех дНТФ, составные части новых комплементарных цепей ДНК.
4. Фермент термостабильная ДНК-полимераза - термостабильная Тац-полимераза или ТФ- полимераза или др., катализирующая удлинение праймеров путем последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК.
5. Фермент ревертаза - синтезирует кДНК на матрице РНК.
6. Фермент Ю4А-зин - фермент, препятствующий работе РНК-аз (ферментов деструктурирующие молекулы РНК) (Брюханов А.Л., 2012; УПюеп ат., 2005).