Филогенетический анализ изолятов реовируса кур и изучение биологических свойств изолята ARV04/02rus, выделенного на территории РФ

• Автор: Зиняков, Николай Геннадьевич
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 147 с. : ил.

Список использованных сокращений
а.о. аминокислотный остаток
дцРНК двухцепочечная РНК
ТС вирусный теносиновит
MAC малабсорбционный синдром
ИСВЧ инфекционная субвирусная частица
Б-ИФА непрямой жидкофазный блокирующий вариант
иммуноферментного анализа «ДНК ДНК-копия с РНК-матрицы
КЭ куриный эмбрион
мРНК матричная РНК
НТО нетранслируемая область
дНТФ дезоксинуклеозидтрифосфат
ОРС открытая рамка считывания
ОТ-ПЦР реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная
реакция
ОТ-ПЦР-РВ реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная
реакция в режиме реального времени п. н. пара нуклеотидов
РК реовирус кур
СПФ-куры куры свободные от патогенных факторов
КККФ, КФ культура клеток куриных фибробластов
ТЦД50 50-и процентная тканевая цитопатическая доза
ХАО хориоаллантоисная оболочка
ЭЭЖ экстраэмбриональная жидкость
РДП реакция диффузной преципитации
ARV реовирус птиц (avian orthoreovirus)
MRV реовирус млекопитающих (mammalian orthoreovirus)
NJ Neighbor-Joining алгоритм анализа
STE трис-солевой буфер
ТВЕ трис-боратный буфер

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. История изучения заболевания
1.2. Характеристика реовирусов птиц
1.2.1. Устойчивость к физико-химическим воздействиям
1.2.2. Морфология возбудителя и белковая структура вириона
1.2.3. Структура генома ортореовирусов
1.3. Репродукция вируса
1.3.1. Проникновение и раздевание
1.3.2. Экспрессия генов и синтез вирусных белков
1.3.3 Сборка вирионов и выход из клетки
1.3.4. Влияние на клеточную пролиферацию
1.3.5. Влияние реовируса кур на клеточный метаболизм
1.4. Патогенные свойства реовирусов птиц
1.4.1. Круг хозяев и возможные пути заражения
1.4.2. Патотипы реовируса кур
1.4.3. Зависимость патологоанатомических признаков болезни от

возраста птицы и сопутствующих инфекций
1.5. Диагностика заболевания
1.6. Серологическая классификация штаммов
1.7. Вакцинопрофилактика
1.8. Заключение по обзору литературы
2. Собственные исследования
2.1. Материалы
2.1.2. Оборудование
2.1.3. Специальные компьютерные программы
2.2. Методы
2.2.1. Выбор праймеров
2.2.2. Выделение нуклеиновой кислоты

2.2.3. Синтез кДНК и постановка ПЦР
2.2.4. Реакция секвенирования и очистка продуктов ПЦР для секвенирования
2.2.5. Анализ последовательностей ПЦР-ампликонов реовируса кур.
2.2.6. Постановка ОТ-ПЦР-РВ
2.2.7. Определение аналитической чувствительности ОТ-ПЦР-РВ
2.2.8. Экспериментальное заражение 3-суточных цыплят изолятом АРУ04/02шз
2.2.9. Заражение 11-суточных эмбрионов СПФ-кур изолятом реовируса кур АИ/04/02ги8
2.2.10. Работа с культурой клеток по изучению цитопатического действия изолята АРУ04/02гив на культуре клеток
2.2.11. Определение инфекционной активности
2.2.12. Определение активности антигена реовируса кур в непрямом жидкофазном блокирующем варианте ИФА
2.2.13. Определение рабочего разведения блокирующих антител, антивидового конъюгата
2.2.14. Определение рабочего разведения антигена
3. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1. Исследование проб патологического материала
3.2. Анализ изолятов реовируса кур, выявленных при исследовании патологического материала
3.2.1. Анализ последовательностей гена ЭЗ близкородственных изолятов, выявленных в одном птицеводческом хозяйстве
3.2.2. Анализ последовательностей гена ЭЗ различных изолятов, выявленных в одном птицеводческом хозяйстве
3.2.3. Филогенетический анализ и группирование выявленных изолятов РК
3.3. Исследование возможности применения метода ОТ-ПЦР-РВ для выявления реовируса кур
3.4. Разработка непрямого жидкофазного блокирующего

2. Собственные исследования
2.1. Материалы
2.1.1. Нуклеотидные последовательности. Для расчета праймеров и филогенетического анализа были использованы последовательности из базы данных вепВапк.
2.1.2. Вирусы
В работе был использован вируссодержащий препарат изолята АИ/04/02ги5, выделенного в 2002 году от цыплят бройлеров [13].
Проверку специфичности разработанных методов проводили с использованием различных возбудителей болезней птиц (табл. 3).
Таблица
Вирусы и бактерии, использованные в работе
Микроорганизм Штамм/изолят Источник
Вирус инфекционного бронхита кур штамм H-120 ФГБУ“ВНИИЗЖ”
Вирус болезни Ньюкастла штамм Ла-Сота ФГБУ“ВНИИЗЖ”
Вирус инфекционного ларинготрахеита штамм О ФГБУ“ВНИИЗЖ"
Вирус инфекционной бурсальной болезни штамм БГ ФГБУ“ВНИИЗЖ”
Вирус лейкоза птиц подгруппы J изолят MRL905 ФГБУ“ВНИИЗЖ”
Вирус болезни Марека штамм 3004 ФГБУ“ВНИИЗЖ”
Аденовирус птиц серотипы 1-12 ФГБУ“ВНИИЗЖ"
Mycoplasma gallisepticum штамм S6 АТСС*
Mycoplasma sinovia WVU 1853 АТСС
Примечание: * ATCC - American Type Culture Collection
2.1.3. Образцы патологического материала
В процессе выполнения данной работы методом секвенирования кДНК было охарактеризовано 117 изолятов реовируса птиц, выявленных в образцах патологического материала от кур из различных птицеводческих хозяйств Российской Федерации, Республики Беларусь и Украины (табл. 4).
Таблица
Перечень изолятов реовируса кур, выявленных на территории РФ с
2007 по 2011 г.г. методом ОТ-ПЦР и охарактеризованных секвенированием фрагментов гена S3
№ Изолят Птицеводческое хозяйство (птицефабрика) Область (край) Дата выявления
1. ARV01/06rus Ярославский бройлер Ярославская
2. ARV01/07rus Ярославский бройлер Ярославская