Совершенствование методов выявления вируса гриппа птиц А/Н5N1 путем создания высокочувствительных диагностических систем

• Автор: Левченко, Наталия Витальевна
• Шифр специальности: 03.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 145 с. : 8 ил.

Оглавление

Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов

Введение
Г лава 1. Анализ эпидемиологической обстановки по гриппу птиц и современного состояния индикации его возбудителя (обзор литературы)

1.1. Эпидемиологическая обстановка по гриппу птиц

1.2. Иммунохимические и геннодиагностические системы для индикации вируса гриппа птиц в объектах окружающей среды и биологическом материале
1.3. Использование иммобилизованных носителей с целью совершенствования диагностических систем для выявления возбу-

дителей инфекционных болезней Собственные исследования Глава 2. Материалы и методы

2.1. Получение антигена вируса гриппа птиц и антивирусных сывороток

2.2. Иммунофлуоресцентные и иммуноферментные конъюгаты, применяемые при выявлении вируса гриппа птиц
2.3. Постановка полимеразной цепной реакции
2.4. Физико-химические методы анализа зд
2.5. Матрица и модификаторы магяоимму носорбентов 5
2.6. Постановка реакции агглютинации латекса
2.7. Используемые препараты для контроля специфичности
2.8. Лиофилизация биологического материала
2.9. Статистическая обработка материалов
Глава 3. Совершенствование индикации вируса гриппа птиц путем разработки иммунодиагностических препаратов 5
3.1. Получение латексного диагностикума 5

3.2. Приготовление иммунофлуоресцентных конъюгатов, используемых в количественном иммунофлуоресцентном анализе при выявлении вируса гриппа птиц А/НЗИ1 ^
3.3. Получение иммунопероксидазных конъюгатов, применяемых для иммунофермснтного метода обнаружения вируса гриппа птиц А/'Н5К1, сконцентрированного на магнитных иммуносорбентах
Глава 4. Разработка метода селективного концентрирования вируса гриппа птиц из объектов окружающей среды с помощью магнитных иммуносорбентов и устройств для работы с ними
4.1. Создание и характеристика магнитных иммуносорбентов
4.2. Разработка и использование установок для селективного концентрирования вируса гриппа птиц на магноиммуносорбен-

Глава 5. Твердофазные системы для индикации вируса гриппа птиц А/Н5Ш
5.1. Количественный иммунофлуоресцентный анализ с использованием магнитных иммуносорбеитов для обнаружения вируса гриппа птиц в объектах окружающей среды ^
5.2. Постановка иммуноферментного метода индикации вируса гриппа птиц с использованием в качестве твердой фазы магнитных иммуносорбентов
5.3. Использование магнитных иммуносорбентов для селективного концентрирования вируса гриппа птиц с последующим выявлением его методом полимеразной цепной реакции с обратной

транскрипцией
Заключение
Выводы
Практические рекомендации
Благодарности
Список использованной литературы 11 о
Приложения

Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и
терминов
БСА бычий сывороточный альбумин
ВОЗ Всемирная организация здравоохранения
ВГП вирус гриппа птиц
ЗФР забуференный физиологический раствор
ИАЖ иммунная асцитическая жидкость
ИФА иммуноферментный анализ
ИС иммуносорбент
кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота
КББ карбонат-бикарбонатный буфер
КИФА количественный иммунофлуоресцентный анализ
КМИС композиционные магноиммуносорбенты
ЛБТК лаборатория бактериологического и технологиче-
ского контроля
МИБП медицинские иммунобиологические препараты
МИС магноиммуносорбент
МН реакция микронейтрализации
МКАТ моноклональные антитела
МС магносорбент
МФА метод флуоресцирующих антител
НИР научно-исследовательская работа
нг нанограмм
об/мин обороты в минуту
ОМБТ основные медико-биологические требования
ОП оптическая плотность
ОТ-ПЦР реакция обратной транскрипции с последующей
полимеразной цепной реакцией
гриппозный диагностикум для РТГА (Онищенко Г.Г., 2006). Используя данный диагностикам или штамм вируса с определенным типом гемагглготини-на (НА) в реакциях РТГА и МН оценивают также наличие специфических антител в крови иммунизированных, а также больных и переболевших птиц, животных и человека, включая парные сыворотки больного (Каримова Т.В. с соавт., 2006; Рекомендации по клинике, дифференциальной диагностике и лечению людей, инфицированных высокопатогеиным вирусом гриппа А/Н5ЙИ, 2006; Курская О.Г. с соавт., 2009).
Типоспецифические сыворотки к другому поверхностному антигену вируса гриппа - нейраминидазе (НА) в тесте нейтрализации активности фермента позволяют определять его серологические разновидности. Ферментативная активность нейраминидазы и эффективность ее ингибиторов (специфических иммуноглобулинов и других соединений) оценивают в колометри-ческом тесте обычно с применением в качестве субстрата молекул фетуина — природного белка с молекулярной массой 51 кДа, несущего остатки нейра-миновой кислоты. Способность фетуина специфично фиксироваться за счет наличия в нем олигосахаридов на рецепторных участках вирусного гемагг-лютинина (НА) используют также для изучения различных противовирусных ингибиторов связывания в реакциях конкурентного ингибирования. Определение ингибирующего действия исследуемого вещества на штаммы вируса гриппа проводят путем сравнения связывания вирусом фетуина, конъюгированного пероксидазой хрена, в присутствии ингибитора и без него. Для этого лунки планшетов для иммуноферментного анализа сенсибилизируют фетуи-ном, затем туда последовательно вносят вирус гриппа, при необходимости ингибитор связывания, затем фетуин, конъюгированный с пероксидазой хрена, и фермент-субстратную смесь, изменяющую цвет в зависимости от количества в лунке фермента пероксидазы. После каждого внесения компонентов реакции в лунки на определенное время их тщательно отмывают от несвя-завшихся компонентов реакции (Гончарова Е.П. с соавт., 2006).