Ингибиторы протеиназ из клубней картофеля и их роль в защитной системе растения

• Автор: Парфенов, Игорь Александрович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ
2. СЕРИНОВЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ПРИРОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
2Л. СТРУКТУРА СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И МЕХАНИЗМ ИХ ДЕЙСТВИЯ
2.2. БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ
2.2.1. Классификация и распространение
2.2.2. Молекулярная структура ингибиторов протеиназ
2.2.3. Механизм действия ингибиторов протеиназ
2.2.4. Ингибиторы сериновых протеиназ
2.2.5. Геномная организация генов, кодирующих ингибиторы протеиназ в растениях
2.2.6. Семейство соевого ингибитора трипсина Кунитца (БКТІ)
2.2.7. Ингибиторы протеиназ из картофеля
2.2.8. Функции ингибиторов протеиназ в растениях
2.2.8.1. Запасные белки растений
2.2.8.2. Участие в контроле эндогенных ферментов
2.2.8.3. Участие в защитных механизмах
2.2.9. Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1.Оборудование
3.2. Реактивы и расходные материалы
3.3. Методы
3.3.1. Выделение и очистка белкового ингибитора

3.3.1.1. Осаждение белков из клубней картофеля
3.3.1.2. Гель хроматография водорастворимых белков
3.3.1.3. Ионообменная хроматография белков
3.3.1.4. Определение концентрации белка
3.3.2. Определение ингибирующей активности белков по отношению к
протеиназам
3.3.3. Ds-Na-ПААГ-Электрофорез
3.3.4. Определение массы ингибитора и его комплексов
3.3.5. Определение N-концевой последовательности белка
3.3.6. Определение термо - и pH-стабильности белка
3.3.7. Определение фунгицидной активности белка-ингибитора
3.3.8. Выделение РЖ
3.3.9. Амплификация к ДНК с помощью ОТ-ПЦР
3.3.10. Клонирование продуктов ГИДР
3.3.11. Выделение плазмидной ДНК
3.3.12. Электрофорез ДНК
3.3.13. Секвенирование продуктов ПЦР
3.3.14. Программное обеспечение, использованное для обработки
результатов секвенирования и реконструкции нуклеотидных
последовательностей амплифицированных генов
3.3.15. Гетерологичная экспрессия белка
3.3.15.1. Создание генно-инженерной конструкции
3.3.15.2. Трансформация клеток E.coli экспрессионной плазмидой
3.3.15.3. Оптимизация условий экспрессии
3.3.15.4. Препаративная экспрессия

3.3.16. Выделение и очистка рекомбинантного белка PKPIJ-B
3.3.16.1. Ренатурация белка PKPIJ-B
3.3.16.2. Хроматография рекомбинантного белка
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Выделение и очистка белка-ингибитора а-химотрипсина
4.2. Определение молекулярной массы ингибитора и его комплексов с а-химотрипсином и трипсином
4.3. Определение N-концевой последовательности
4.4. Определение pH и термостабильности
4.5. Изучение фунгицидной активности белка PKCI
4.6. Клонирование геномных нуклеотидных последовательностей, кодирующих ингибиторы PKPI-B в картофеле сорта Юбилей Жукова
4.7.Гетерологичная экспрессия белка PKPIJ-B
4.8. Аминокислотная последовательность белка PKCI
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

принимает форму, близкую к петле связывания ингибитора трипсина из эритрины Erythrina caffra (ETI), отнесенного к тому же семейству [115].
Несмотря на наблюдаемое разнообразие структур ингибиторов, механизмов действия и специфичности по отношению к протеиназам, предполагается существования конечного, ограниченного числа допустимых вариантов молекул ингибиторов. Это предположение опирается на данные, свидетельствующие о конвергенции структуры и функций белков, относящихся к различным, эволюционно не родственным семействам ингибиторов [158].
2.2.6.Семейство соевого ингибитора трипсина Кунитца (SKTI)
Первый белок, давший название семейству, был выделен Кунитцем из бобов сои (Glyicine тах (L.) Мегг.) в 1945 году и впоследствии детально охарактеризован [202, 207]. Представители семейства SKTI широко
распространены среди одно- и двудольных растений [15].
Семейство SKTI представляет собой группу белков-ингибиторов протеиназ, большинство из которых имеют молекулярную массу около 20 кДа и состоят из 160-200 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь [15]. В сферической форме молекул ингибиторов этого семейства одна полипептидная цепь укладывается в 12 антипараллельных ß-цепей, образующих псевдосимметричную структуру (рис. 4) [56, 127, 174]. Большинство представителей семейства имеют в своем составе две дисульфидные связи Cys63-Cysll0 и Cysl60-Cysl69, формирующие две петли, при этом в первой расположен реактивный центр связывания с трипсином [15].
Молекулы ряда белков, выделенных из картофеля и бобовых растений, состоят из двух полипептидных цепей, большой а-цепи и малой ß-цепи, имеющие молекулярную массу около 15 и 5 кДа соответственно, которые соединены одной дисульфидной связью [6, 15, 166, 174]. Формирование