Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispa

• Автор: Ткачева, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 102 с. : ил.

Благодарности за научное сотрудничество и помощь в работе.
Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.х.н., зав. лаб. Козловской Э.П., сотрудникам ЛХП: д.х.н. Монастырной М.М. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы и обсуждении результатов, к.х.н. Лейченко Е.В. за практическую помощь и постоянное внимание к работе и к.ф-м.н. Зелепуга Е.А. за проведение работ по молекулярному моделированию и участие в обсуждении результатов, а также сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н. Исаевой М.П. за неоценимую помощь в проведении экспериментов по молекулярной биологии, за критический анализ текста диссертации и автореферата. Автор также благодарен сотрудникам других лабораторий за помощь в выполнении отдельных этапов работы: к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., м.н.с. Гузеву К.В, к.б.н. Черникову О.В., к.х.н. Дмитренку П.С., к.х.н. Анастюку С.Д.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1Л. Пороформирующие токсины. Классификация
1.2. Актинопорины
1.2.1. Физико-химические характеристики и структура актинопоринов
1.2.2. Механизм действия актинопоринов
1.2.3. Перспективы изучения механизма действия актинопоринов
1.2.4. RGD-мотив актинопоринов
1.3. Связь структуры актинопоринов и функции. Сайт-направленный мутагенез
1.4. Мультигенные семейства актинопоринов
1.5. Актинопорин-подобные белки (АПБ)
1.6. Фармакологические исследования актинопоринов
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выделение актинопоринов из актинии Heteractis crispa
3.2. Клонирование генов актинопоринов
3.3. Филогенетический анализ последовательностей актинопоринов
3.4. Экспрессия, выделение, функциональная активность рекомбинантных актинопоринов
3.5. Сайт-направленный мутагенез
3.6. Структурно-функциональный анализ актинопоринов - представителей семейств Hct-A и Hct-S
3.6.1. Компьютерное моделирование рекомбинантного актинопорина rHct-S3
3.6.2. Выяснение функциональной значимости а.о. рекомбинантных актинопоринов при порообразовании
3.6.3. In silico исследование комплекса актинопорина с лигандом, фософорилхолином

ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а.о. - аминокислотный остаток
АПБ - актинопорин-подобный белок
БЛМ - бислойные липидные мембраны
БСА - Бычий сывороточный альбумин
ДСН - додецилсульфат натрия
ИПТГ (IPTG) - изопропил-Р-О-тиогалактозид
МД - молекулярная динамика
п.н. - пары оснований
ПААТ - полиакриламидный гель
ПФТ - пороформирующий токсин
ПЦР - полимеразная цепная реакция
СМ - сфингомиелин
ФХ -фосфатидилхолин
X - холестерин
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
АР-1 и NF-кВ ядерные факторы - факторы транскрипции
GST - глутатион трансфераза
IOR С5 - раковый антиген толстого кишечника
IOR-T6 - антиген, экспрессируемый на зрелых Т-лимфоцитах
Р1(4,5)Р2 - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата
РОС-связывающий сайт - фосфорил холиновый сайт связывания актинопорина с мембраной
RGD-мотив - трипептид (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота)
RMSD (root mean square deviation) - среднеквадратичное отклонение
SRP - поверхностный плазмонный резонанс
ТМ-домен - трансмембранный домен
X-Gal - 5-бром-4-хлориндолил-р-Д-галактозид

2006; Kamoun, 2006). Данные белки инициируют некроз и стимулируют иммунную защиту у двудольных растений (Kamoun, 2006; Gijzen and Nürnberger, 2006). Сравнение пространственных структур актинопоринов и Р. aphanidermatum NLP выявило значительную степень сходства 3D структур этих белков (Ottman et al., 2009). Интересно, что этилен-индуцируемые пептиды сохраняют N-концевой а-спиральный фрагмент, который участвует в инициации некроза и активации защитных функций растений (Fellbrich et al., 2002).
Рис. 20. Ленточные диаграммы 3 D-структуры лектинов и актинопоринов.
(A) AGAbisl (PDB ID: 1Y2T) из A. hisporus, XERchrl (PDB ID: 1XIO) из X. chrysenteron и Stnll (PDB ID: 1GWY) из S. helianthus (Koradi et al., 1996).
(Б) суперпозиция Са-атомов актинопорина RTX-A (показан черным цветом) и лектина XCL из X. chrysenteron (PDB код 1X99) (Birck et al., 2004) (показан серым цветом). Структуры получены в результате гомологичного моделирования с помощью SPDB программы и Swiss-Model сервера. N- и С-концевые участки обозначены буквами «N» и «С» для RTX-A и «N’» и «С’» для XCL.
Показано, что прединкубация со СМ двух пороформирующих белков, Ucl и Upl (с молекулярными массами 30 кДа и 28 кДа соответственно), обнаруженных недавно в Северных актиниях Urticina crassicornis и Urticina piscivora (Razpotnik et al., 2009) и отличающихся N-концевой последовательностью от таковой у актинопоринов других видов, не ингибирует гемолитическую активность. В то же время токсины связываются с монослойными липосомами и БЛМ, содержащими СМ и X. Вероятно, что оба белка принадлежат к новому семейству цитолизинов актиний, которое, очевидно, будет расширено и исследовано в дальнейшем.
Интересно, что третичная структура актинопоринов имеет сходство с рецепторным доменом 4 молекулы перфинголизина О (рис. 21), холестерин-зависимого (3-ПФТ из С. perfringens. Этот домен также имеет

AGAbisl
Stun
XERflul