Применение пероксидазы сои в иммуноферментном анализе

• Автор: Берлина, Анна Николаевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунохимические методы анализа

1.1.1. Понятие и классификация антигенов

1.1.2. Строение и функции антител

1.1.3. Классификация иммунохимических методов анализа

1.1.4. Реакции с использованием меченых антител или антигенов

1.1.5. Разнообразие методов ИФА

1.1.5.1. Гомогенные методы иммуноанализа

1.1.5.2. Гетерогенные методы иммуноанализа

1.2. Применение реакции авидин-биотин в ИФА
1.3. Аналитические характеристики иммуноанализа
1.4. Применение ферментов в ИФА
1.4.1. Требования к ферментам, используемым в ИФА в качестве меток
1.4.2. Характеристика класса пероксидаз
1.4.3. Пероксидаза хрена
1.4.4. Механизм окисления субстратов под действием пероксидаз («пинг -
понг» механизм)
1.4.5. Альтернативные пероксидазы. Пероксидаза сои
1.4.6. Субстраты пероксидаз
1.4.7. Методы определения каталитической активности пероксидаз в ИФА
1.4.8. Механизм хемилюминесцентной реакции
1.5. Сульфаниламидные препараты
1.5.1. Фармакологическая характеристика и механизм действия
сульфаниламидов
1.5.2. Влияние сульфаниламидов при попадании в окружающую среду
1.5.3. Эффекты сульфаниламидных препаратов при попадании в организм
человека и животных
1.5.4. Методы анализа образцов на наличие сульфаниламидов
1.5.5. Влияние матрикса биообразцов на определение сульфаниламидных
препаратов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки кроликов
2.2.2. Биотинилирование антител

Список сокращений
АБТС - диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты)
Ат - антитела
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФА - диметилформамид
ИФА - иммуноферментный анализ
ИХМ - иммунохимический метод (методы)
ОВА - овальбумин
ПАБК — пярл-аминобензойная кислота
ПС - пероксидаза сои
ПХ - пероксидаза хрена
ПЭГ — полиэтиленгликоль
САМ - Ы-сульфанил-4-амииомасляная кислота
СМП - сульфаметоксипиридазин
СТР - стрептавидин
тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ ТМБ - 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин ТХУ - трихлоруксусная кислота ФБ - фосфатный буфер
ФБС - 50 мМ фосфатный буферный раствор с 0,1 М ИаС1, pH 7,4 ФБС-Т - ФБС с 0,05% Тритона Х-100, pH 7,4 ХЛ - хемилюминесценция
ХЛ-тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ с хемилюминесценгной детекцией
- иммуноглобулин класса в
2.2.3. Определение авидности антител после их биотинилирования
2.2.4. Синтез конъюгата (антитела против 1§С кролика — пероксидаза сои)
2.2.5. Синтез конъюгатов СТР-ПС и СТР-ПХ
2.2.6. Измерение пероксидазной активности методом колориметрии
2.2.7. Оптимизация условий для хемилюминесцентной детекции с использованием пероксидазы сои
2.2.8. Измерение пероксидазной активности методом хемилюминесценции
2.2.9. Определение термостабильности конъюгатов стрептавидин-пероксидаза (сои, хрена)
2.2.10. Твердофазный ИФА СМП (формат с использованием конъюгатов СТР-ПС или СТР-ПХ)
2.2.11. Твердофазный ИФА СМП (формат с использованием антивидовых меченых антител)
2.2.12. Пробоподготовка образцов молока для тИФА с колориметрической детекцией
2.2.13. Пробоподготовка образцов молока для тИФА с хемилюминесцентной детекцией
2.2.14. Пробоподготовка образцов озерной воды для тИФА с хемилюминесцентной детекцией
2.2.15. Определение состава конъюгатов
2.2.16. Обсчет данных и получение значений аналитических характеристик метода тИФА
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение и характеристика реагентов для проведения тИФА
3.2. Оптимизация условий для ХЛ-тИФА с использованием ПС в качестве метки
3.3. Получение и сравнение основных аналитических характеристик ХЛ-тИФА для определения СМП с использованием ПХ и ПС в качестве меток
3.4. Определение СМП в молоке методом тИФА с колориметрической детекцией
3.5. Определение СМП в молоке методом тИФА с хемилюминесцентной детекцией
3.6. Определение СМП в озерной воде методом ХЛ-тИФА
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ре(1
Соединение I
— Ре (II)— Н
Ферро-фермент

Рис. 8. Пять состояний активного центра пероксидаз растений [151]. Основное состояние представлено ферри-ферментом, который при одноэлектронном восстановлении образует ферро-форму; последняя присоединяет молекулу кислорода и образует т.н. Соединение III. Каталитический цикл пероксидазной реакции включает Соединение I, которое образуется при двухэлектронном окислении железа активного центра и предсталяет собой феррил-форму и катион-радикал на порфириновом кольце, и Соединение II, продукт одноэлектронного восстановления Соединения I. Под действием избытка перекиси Соединение II образует Соединение III, однако при таком способе образования оно быстро разлагается под действием избытка перекиси (не показано)