Создание иммуногена на основе белка p17 ВИЧ-1 субтипа A

• Автор: Аль-Шехадат, Руслан Исмаилович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 192 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
Актуальность проблемы
Цель и задачи исследования
Научная новизна работы
Научно-практическая значимость работы
Форма выполнения диссертационной работы
Апробация работы
Объем и структура диссертации
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Общая характеристика белка р 17 ВИЧ-1
1.2 Вирионная форма белка р 17
1.3 Внутриклеточная форма белка р17
1.4 Экстраклеточная форма белка pi 7
1.5 Структура эпитопов белка р 17
1.6 Белок pi 7 как терапевтическая вакцина против ВИЧ-1
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Плазмидные ДНК, использованные в работе
2.1.1 Плазмида pET151/D-TOPO
2.1.2 Плазмиды pBMCGagHum и pBMCGagNat
2.2 Бактериальные штаммы
2.3 Реакции ферментативной модификации ДНК и РНК
2.3.1 Амплификация последовательностей генов pi 7Na1 и р! 7Mod 5
2.3.2 Скрининг колоний E. coli с использованием ПЦР
2.3.3 Рестрикция плазмидной ДНК
2.3.4 Встраивание фрагментов ДНК в вектор pET151/D-TOPO
2.3.5 Секвенирование ДНК по методу Сэнджера
2.3.6 Синтез кДНК
2.3.7 ПЦР в реальном времени с использованием SYBR GREEN
2.4 Электрофорез нуклеиновых кислот
2.4.1 Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле
2.4.2 Препаративный электрофорез ДНК и выделение ДНК из агарозного геля

2.5 Микробиологические методы
2.5 Л Приготовление компетентных клеток E.coli для трансформации
2.5.2 Трансформация клеток E. coli
2.5.3 Индукция экспрессии гена, кодирующего рекомбинантный бедок,
в штамме-продуценте
2.5.4 Автоиндукция экспрессии 0.2% лактозой по методу Штудиера
2.6 Очистка нуклеиновых кислот
2.6.1 Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli
2.6.2 Очистка и обессоливание ДНК
2.6.3 Выделение РНК из клеток E. coli
2.7 Анализ и хроматография белков
2.7.1 Диск-электрофорез белков в денатурирующих условиях
по методу Леммли
2.7.2 Окрашивание белков в полиакриламидных гелях
2.7.3 Иммуноблоттинг
2.7.4 Разрушение бактериальных клеток в нативных условиях
2.7.5 Разрушение бактериальных клеток в денатурирующих условиях
2.7.6 Иммобилизованная металлоаффинная хроматография
в нативных условиях
2.7.7 Иммобилизованная металлоаффинная хроматография
в денатурирующих условиях
2.7.8 Определение концентрации белка по методу Бредфорд
2.7.9 Концентрирование белка методом ультрафильтрации
2.7.10 Сублимационное высушивание препарата белка р17
2.8 Статистический анализ полученных результатов
2.9 Компьютерные методы анализа данных
2.10 Синтетические пептиды
2.11 Иммунологические методы и методы работы с животными
2.11.1 Лабораторные животные
2.11.2 Иммунизация лабораторных животных различными дозами белка р17
2.11.3 Иммунизация лабораторных животных белком р17
в сочетании с различными адъювантами
2.11.4 Иммунизация лабораторных животных белком р!7
при различных путях введения антигена

2.11.5 Иммунизация лабораторных животных белком р17 для изучения особенностей иммунного ответа
при интраназальном введении антигена
2.11.6 Выделение спленоцитов и определение антиген-специфической пролиферации
2.11.7 Индукция цитокинов в культурах спленоцитов
2.11.8 Определение уровней цитокинов в супернатантах
2.11.9 Иммунизация лабораторных животных белком р 17 при смешанном пути введения антигена
2.11.10 Определение титра антител методом иммуноферментного анализа
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Клонирование последовательностей природного (нативного) гена pi 7Nat и модифицированного гена pi 7Mod, кодирующих белок р 17, в плазмидном векторе для экспрессии pET151/D-TOPO
3.2 Динамика роста клеток E.coli штаммов BL21pl7Nat и BL21pl7Mod после индукции экспрессии 1 мМ ИПТГ и без индукции
3.3 Динамика биосинтеза рекомбинантного белка pi7 клетками E.coli штаммов BL21pl7Nat и BL21pl7Mod после индукции экспрессии 1 мМ ИПТГ
3.4 Биосинтез рекомбинантного белка р17 клетками E.coli штаммов BL21pl7Nat и BL21pl7Mod после автоиндукции экспрессии
0.2% лактозой по методу Штудиера
3.5 Иммуноблоттинг рекомбинантного белка р
3.6 Определение растворимости рекомбинантного белка р17 при его синтезе в клетках E.coli штамма BL21pETpl7Mod
3.7 Частичная очистка рекомбинантного белка pi 7 из лизатов клеток E.coli штамма BL21pl7Mod методом ИМАХ с использованием сорбента Ni-НТУ сефарозы
3.8 Определение G+C состава нативного и модифицированного генар17
3.9 Определение состава редких для E. coli кодонов в нативном и модифицированном генах, кодирующих белок р17
3.10 Расчет вторичных структур мРНК, транскрибирующихся
с нативного и модифицированного генов, кодирующих белок р17

антитела ассоциированы с защитой от таких вирусных инфекций, как ящур и корь (Steward et al., 1991; Nara et al., 1991; Olszewska et al., 2000), и с благоприятным прогнозом патологии гепатита В (Wen et al., 1990). Моноклональные антитела с низкой константой диссоциации со специфичностью к V3 петле более эффективно нейтрализуют ВИЧ-1 in vitro, чем антитела с высокой константой диссоциации (VanCott et al., 1994).
Существует много гипотез, объясняющих падение уровня антител и уменьшение количества высокоаффинных антител у пациентов с прогрессией СПИДа. Так как для созревания и поддержания высокоаффинных антител необходимы функциональные CD4+ Т клетки, то у пациентов быстро прогрессирующих к СПИДу, вероятно, изначально было инфицировано большее количество CD4+ Т клеток, что и могло повлиять на падение аффинности антител (Pantaleo et al., 1993; Embretson et al., 1993; Shearer and Clerici, 1991). У некоторых пациентов наблюдалось увеличение количества CD8+ цитотоксических Т клеток, которые способствуют иммунопатологии ВИЧ путем разрушения инфицированных CD4+ Т клеток (Zinkernagel and Hengartner, 1994). Увеличение репликации и размножения вируса приводит к увеличению количества антигена, при этом в первую очередь в формировании иммунных комплексов будут принимать участие высокоаффинные антитела, что, вероятно, и приводит к детекции низкоаффинных антител у пациентов со СПИДом. Однако, уменьшение падения уровня специфических антител против белка Gag не ассоциировано с увеличением количества белка р24 в крови пациентов. Более того, наличие низкоаффинных антител не обязательно связано с высоким уровнем белка р24, даже после диссоциации иммунных комплексов (Chargelegue et al., 1995).
Несмотря на отсутствие единой доказанной теории о причинах падения уровня антител и уменьшения их аффинности к белку р17 и его эпитопам,