Исследование структуры и свойств флуоресцентных химер малых белков теплового шока человека

• Автор: Дацкевич, Петр Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 106 с. : ил.

Оглавление:

Список сокращений:

Введение

I. Обзор литературы

1. Малые белки теплового шока (sHsp)

1.1 Структура малых белков теплового шока

L .2 Фосфорилирование малых белков теплового шока

1.3 Малые белки теплового шока человека

1.4 Некоторые функции малых белков теплового шока человека

1.4.1 Предотвращение накопления белковых агрегатов

1.4.2 Защита клеток от апоптоза

1.4.3 Взаимодействие малых белков теплового шока с элементами цитоскелета
1.4.4 Внеклеточные функции малых белков теплового шока
2. Флуоресцентные белки
3. Использование флуоресцентных белков для исследования малых белков теплового шока
4. Линкерные последовательности в химерных белках
II. Цели и задачи
III. Материалы и методы
1. Получение молекулярно-генетических конструктов
2. Получение химически компетентных клеток E. coli
3. Экспрессия химерных белков
3.1 Выращивание бактериальных культур
3.2 Тестовая экспрессия
3.3 Препаративная экспрессия
4. Выделение и очистка рекомбинантных белков
4.1 Выделение и очистка химерных белков
4.2 Выделение и очистка белков из телец включения с последующей ренатурацией
4.3. Выделение и очистка рекомбинантных флуоресцентных белков
5. Исследование олигомерного состояния
5.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков
5.1.1 Динамическое лазерное светорассеяние
5.1.2 Гель-хроматография

5.1.3 Электронная микроскопия
5.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков
6. Флуоресцентные методы исследования
6.1 Измерение спектров возбуждения и флуоресценции химерных белков
6.2 Исследование взаимодействия химерных белков и белков дикого типа с использованием явления фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET)
6.2.1 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между разными флуоресцентными белками (гетеро-FRET)
6.2.2 Измерение фёрстеровского резонансного переноса энергии между одинаковыми флуоресцентными белками (гомо-FRET)
6.2.3 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гетеро-FRET
6.2.4 Исследование взаимодействия белков посредством измерения гомо-FRET
7. Исследование шапероноподобной активности
8. Некоторые аналитические методы
8.1 SDS-электрофорез по методу Леммли
8.2 Иммунохимическое окрашивание (Western Blotting)
8.3 Спектрофотометрическое определение концентрации белка
IV. Результаты и их обсуждение
1. Подбор условий экспрессии химерных белков
2. Выделение и очистка белков
2.1 Выделение и очистка химерных белков
2.2 Выделение химерных белков из телец включения
3. Исследование олигомерного состояния химерных белков
3.1 Исследование гомоолигомеров химерных белков
3.2 Исследование гетероолигомеров химерных белков
4. Шапероноподобная активность химерных белков
V. Заключение
Выводы:
Список литературы:

Список сокращений:
ДТТ - дитиотрейтол
fS-МЭ - р-меркаптоэтанол
ДСН - додецилсульфат натрия
ПААГ - полиакриламидный гель
Трис - трис(гидроксиметил)аминометан
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
Amp - ампициллин
АР - антипараллельный интерфейс
eCFP - улучшенный циановый флуоресцентный белок (enhanced cyan fluorescent protein)
eYFP - улучшенный желтый флуоресцентный белок (enhanced yellow fluorescent protein)
FRET - Фёрстеровский резонансный перенос энергии
GSH - восстановленный глутатион
Hsp - белки теплового шока (Heat shock proteins)
1PTG — изопропил-fl-D-l -тиогачактопиранозид
LB - питательная среда Луриа-Бертани
PI3K - фосфоинозитид-3-киназа
РКС - протеинкиназа С
PMSF - фенилметансульфонил фторид
sHsp - малые белки теплового шока (small heat shock proteins)
WT - белки дикого типа (wild type)

II. Цели и задачи
Целью данной работы был анализ структуры и свойств различных типов химерных флуоресцентных белков, состоящих из малых белков теплового шока человека НзрВ 1, НзрВ5, НзрВб. НярВ8 и флуоресцентных белков ЕСЕР или ЕУЕР. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:
1) Получить молекулярно-генетические конструкты, несущие кДНК химерных флуоресцентных белков, отличающихся по составу, комбинации частей химеры и длине и природе линкера.
2) Разработать методику выделения химерных флуоресцентных белков и получить их в гомогенном состоянии.
3) Исследовать четвертичную структуру флуоресцентных химер вНяр.
4) Проанализировать взаимодействие химерных белков между собой и белками
дикого типа, их способность обмениваться субъединицами и формировать гетероолигомерные комплексы.
5) Исследовать шапероноподобную активность химерных белков.
6) Изучить влияние состава и длины линкерных последовательностей на свойства
химерных белков.