Влияние экзогенных и эндогенных эффекторов на конформацию ангиотензин-превращающего фермента человека

• Автор: Петров, Максим Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. АНГИОТЕНЗИП-ПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ

1.1. Физиологическая значимость ангиотензин-превращающего фермента

1.2. Структура ангиотензин-превращающего фермента

1.3. Взаимное функционирование доменов в составе соматического ангнотензин-

превращающего фермента

1.4. Трехмерная структура доменов ангнотензин-превращающего фермента

1.4.1. Структура С-домсна

1.4.2. Структура N-домена
1.4.3. Сравнение строения активных центров N- и С-доменов ангиотензин-превращающего
фермента
1.4.4. Структура двудоменного фермента
2. ИНГИБИТОРЫ АНГИОТЕШИП-НРЕШ'ЛЩЛЮЩЕГО ФЕРМЕНТА
2.1. Ограничения современных ингибиторов АПФ
2.2. Домен-селективные ингибиторы АПФ
2.2.1. N-домен специфичные ингибиторы
2.2.2. С-домен специфичные ингибиторы
2.3. Двойные ингибиторы АПФ и ЭПФ
3. МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА
3.1. Общая характеристика антител и антигенов
3.2. Исследование структуры и функционирования ангиотензин-превращающего фермента с
помощью моноклональных антител к N-домену
3.2.1. Исследование возможной связи между димернзацией и шедцингом ангиотензин-превращающего фермента с поверхности клеточных мембран
3.2.2. Исследование каталитической активности N-домена ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител
3.2.3. Изучение конформационных изменений соматического ангиотензин-превращающего фермента при взаимодействии с ингибиторами
3.3. Исследование структуры и функционирования ангиотензин-превращающего фермента с
помощью моноклональных антител к С-домену
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4. Материалы и методы исследования
4.1. Материалы
4.2. Методы
4.2.1. Выделение и очистка соматического ангиотензин-превращающего фермента
4.2.2. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензин-превращающего фермента
4.2.3. Получение N-домена соматического ангиотензин-превращающего фермента
4.2.4. Определение концентрации и чистоты выделенных препаратов фермента
4.2.5. Определение активности ангиотензин-превращающего фермента
4.2.6. Подготовка пула плазмы крови

4.2.7. Подбор оптимальных концентраций фермента и моноклональных антител для нммуносорбции
4.2.8. Определение констант связывания моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-преврашающимферментом
4.2.9. Изучение влияния ингибиторов АПФ на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом
4.2.10. Определение влияния модификаторов на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом
4.2.11. Моделирование разрывов дисульфндных мостиков в М-домене анпютензин-превращающего фермента
4.2.12. Влияние гемолиза на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом крови
4.2.13. Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5. Определение эффективности связывания моноклональных антител с ангиотензин-
превращающим ФЕРМЕНТОМ ЧЕЛОВЕКА
5.1. Подбор оптимальных условий для иммуносорбции
5.2. Определение констант диссоциации комплексов моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом
5.3. Определение эффективности связывания панели моноклональных антител с различными формами соматического ангиотензнн-превращагащего фермента
6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНГИБИТОРОВ ПА ЭФФЕКТИВНОСТЬ СВЯЗЫВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ ЧЕЛОВЕКА
6.1. Выбор условий отмывки планшетов при иммуносорбции
6.2. Определение влияния энапаприлата и тепротида на связывание панели моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из кропи
6.3. Анализ взаимного влияния доменов при связывании ингибиторов в активных центрах соматического ангнотензмн-превращающего фермента
7. Определение влияния эффекторов па эффективность связывания моноклональных
АНТИТЕЛ с ангиотензин-превращающим ферментом человека
7.1. Определение влияния Б-в восстанавливающих агентов на связывание панели моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из крови
7.2. Влияние восстановления дисульфндных связей на конформационную изменчивость ангиотензин-превращающего фермента под действием ингибиторов фермента
8. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С УРЕМИЕЙ
8.1. Анализ связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом в норме и при развитии уремии
8.2. Анализ ответа конформаниопно измененного ангиотензин-превращающего фермента на связывание ингибиторов АПФ при развитии уремии
8.3. Частота встречаемости конформацнонно измененного ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови условно здоровых доноров
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
сАПФ — соматический ангиотензин-превращающий фермент; тАПФ — тестикулярный ангиотензин-превращающий фермент; мАт - моноклональные антитела;
СНО — клетки яичников китайского хомячка
Ds-Na - додецилсульфат натрия
PMSF — фенилметилсульфонилфторид
Трис (Tris) - трис(гидроксиметил)аминометан
Хепес (Hepes) — 15!-2-гидрокси-этилпиперазин-М-этансульфоновая кислота Ангиотензин -I - Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu
FA-Phe-Gly-Giy (FPGG) - Ыа-3-(2-фурил)-акрилоил-Ь-фенилаланил-Е-глицил-Е-глицин Cbz-Phe-His-Leu (ZPHL) - карбобензокси-Ь-фенилаланил-Ь-гистидил-Ь-лейцин Hip-His-Leu (HHL) - гипнурил-Ь-гистидил-Ь-лейцин His-Leu (HL) - Ь-гистидил-Ь-лейцин
Лизиноприл - (S)-N“-(l -карбокси-3-фенилпропил)-Ь-лизил-Ь-пролин
Эналаприлат-(2.8)-1-[(25)-2-{[(15)-1-карбокси-3-фенилпропил]амино}пропаноил]-пирролидин-2-карбоновая кислота
Тепротид - Glp-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-llc-Pro-Pro
GSH (глютатион, восстановленная форма) — (2S) -2-амино-4 - {[(1R) -1 - [(карбоксиметил) карбамоил] -2-сульфанилэтил] карбамоил} бутановая кислота
GSSG — глютатион, окисленная форма
DTI' (дитиотреитол) - (2S,3S)-1,4-бис(сульфанил)бутан-2,3-диол DTNB — 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота)
MG (метилглиоксаль) -2-оксопропаналь Gu*FICl - гуанидин хлорид
2.2. Домсн-селектнвныс ингибиторы АПФ
2.2.1. N-домен специфичные ингибиторы
Известно, что ряд биологических субстратов АПФ специфичны к N-домену: ангиотензин1'7, амилоидный бета пептид, LHRH и AcSDKP [29,135,136], хотя другие авторы показали, что гидролиз ангиотензина1'7 не домен-специфичен [137]. Возможно, AcSDKP является наиболее важным из этих субстратов. Он впервые был определен как регуляторный пептид, вовлеченный в пролиферацию стволовых гематопоэтических клеток [138]. Кроме этого было показано, что он оказывает ряд положительных эффектов на сердечную систему: предупреждение и лечение фиброза и воспаления сосудов и почек [139]. AcSDKP опосредует эти эффекты, в частности, путем ингибирования дифференциаци, активации и миграции макрофагов и высвобождения цитокинов. Также было показано, что AcSDKP предотвращает повреждение органов вследствие гипертензии [140]. Повышенный вследствие ингибирования АПФ уровень AcSDKP вносит вклад в положительный эффект ингибиторов посредством нового механизма, при котором AcSDKP тормозит отложение коллагена в левом желудочке сердца [141].
Эти данные подчеркивают важность разработки ингибиторов, специфичных к N-домену АПФ, которые могут быть полезны при лечении ряда таких заболеваний, как фиброз легких и почек, при которых ингибирование N-домена выгодно, в то время как С-домен останется активным для регуляции кровяного давления.
Наиболее интересным N-домен селективным ингибитором является RXP407, который демонстрирует 2000-кратную специфичность к N-домену [111]. Аминокислотные остатки Туг369 и Arg381 в S2 кармане ответственны за N-доменную специфичность RXP407, ориентируя его в оптимальном положении (рис. 10 D)[142], Эти данные подтверждают полученные ранее при синтезе RXP407 сведения о том, что варьирование Р2-группы оказало сильное влияние на специфичность ингибитора [111]. Было установлено, что присутствие остатков Glu, Asn и Asp в Р2 положении обеспечило селективность к N-домену, в то время как наличие Arg в Р2’положснии отменяло селективность ингибитора. Значимость S2 кармана в обеспечении селективности RXP407 была подтверждена при изучении кристаллической структуры N-домена в комплексе с этим ингибитором, где было видно, что Туг369 и Arg381 имеют тесные контакты с Р2 группой RXP407 (рис. 10 C-D)[143].