Липопротеид-связывающий 130кДа белок из гладкомышечных клеток сосудов человека : Идентификация, распределение в мембране и регуляции экспрессии

• Автор: Стамбольский, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Молекулы клеточной адгезии
1.1. Иммуноглобулиновое суперсемейство
1.2. Интегриновое семейство
1.3. Селектиновое семейство
1.4. Кадгериновое суперсемейство
1.4.1. Классические кадгерины
1.4.2. Десмосомальные кадгерины
1.4.3. Пр ото кадгерины и родственные протокадгеринам
белки
1.4.4. Родственные кадгеринам белки
1.4.5. Участие кадгеринов в сигнализации
1.5. Т-кадгерин
2. ГФИ-белки
2.1. Участие ГФИ-белков в сигнализации
2.2. Возможное участие ГФИ-белков в реализации
гормоноподобных эффектов липопротеидов
3. Участки мембраны богатые гликолипидами и холестерином
3.1. Кавеолы и кавеолин
3.2. Обнаруженные в составе кавеол сигнальные молекулы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы и методы
11. Культивирование клеток
1.2. Выделение липопротеидов
1.3. Получение поликлональных антител на ЛНП
1.4. Получение Fab-фрагментов антител
1.5. Получение конъюгатов синтетических пептидов с пероксидазой
хрена
1.6. Получение поликлональных антител против пептидов Т-кад герина
1.6.1. Иммунизация кроликов
1.6.2. Иммунизация мышей
1.7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецил -сульфата натрия, лигандный блотгинг и иммуноблоттинг
1.8. Конъюгирование антител с пероксидазой хрена
1.9. Выделение липопротеид-связывающего белка 130 кДа (р130) из медии аорты человека
1.9.1. Выделение мембран медии аорты человека
1.9.2. Солюбилизация белков мембран медии аорты детергентом CHAPS
1.9.3. Ионообменная хроматография на DEAE-Toyopeari
1.9.4. Zn2" -хелатная хроматография
1.9.5. Препаративный электрофорез в полиакриламидном
геле в присутствии додецилсульфата натрия
1.9.6. Электроэлюция белков из полиакриламидного геля
1.9.7. Препаративная изоэлектрофокусировка

1.10. Определение частичной аминокислотной последовательности белка р130
1.11. Определение концентрации белка
1.12. Выделение мембран культивируемых клеток
1.13. Получение препарата тритон-нерастворимых доменов низкой плотности из клеточных мембран и мембран медии аорты
1.14. Материалы
2. Результаты исследования
2.1. Очистка белка р130 и его идентификация
2.1.1. Очистка р 13 0 из мембран медии аорты
2.1.2. Определение частичной аминокислотной последовательности белка р130
2.2. Использование антител для идентификации белка р130
2.2.1. Выбор аминокислотных последовательностей для получения антител против синтетических фрагментов про-Т-кадгерина
2.2.2. Иммуноблоттинг препарата из мембран медии аорты человека, обогащенного р 130 и Т-кадгерином и мембран культивируемых ГМК с использованием полученных антипептидных антител
2.2.3. Влияние кроличьих поликлональных антител против синтетических фрагментов Т-кадгерина на связывание ЛНП с кадгерином и р130 при лигандном (ЛНП-) блоттинге
2.2.4. Влияние РаЬ-фрагментов антител против апо-Вюо на связывание ЛНП с р 130 и Т-кадгерином
2.3 Использование ферментативной обработки культивируемых ГМК из сосудов человека для идентификации белка р130
2.3.1. Обработка клеток, экспрессирующих р130 и Т-кадгерин, трипсином в присутствии кальция
2.3.2. Обработка клеток, экспрессирующих р130 и Т-кадгерин, ГФИ-специфичной фосфолипазой С
2.4. Влияние сыворотки и факторов роста на экспрессию р130 и Т-кадгерина в культивируемых ГМК из медии аорты человека
2.4.1. Влияния сыворотки на экспрессию р130 и Т-кадгерина
в культивируемых ГМК из медии аорты человека
2.4.2. Влияния холестерина на экспрессию р130 и Т-кадгерина в культивируемых ГМК из медии аорты человека
2.4.3. Влияния липопротеид-дефицитной сыворотки на экспрессию р 130 и Т-кадгерина в культивируемых ГМК из медии аорты человека
2.4.4. Влияния факторов роста на экспрессию р130 в культивируемых ГМК из медии аорты человека
2.4.5. Индивидуальный анализ экспрессии р130 и Т-кадгерина в культивируемых ГМК из медии аорты человека под действием сыворотки и факторов роста
2.5. Локализация р 130 и Т-кадгерина в кавеолярных мембранных доменах
2.5.1. Локализация р130 и Т-кадгерина в нерастворимых в тритоне Х-100 мембранных комплексах низкой плотности

2.5.2. Колокализация рІЗО и Т-кадгерина в кавеолярных
мембранах с молекулами, участвующими в сигнализации
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Очистка и определение частичной аминокислотной последовательности белка рІЗО
2. Специфичность антител, полученных на синтетические пептиды из последовательности про-Т-кадгерина
3. Обработка культивируемых ГМК трипсином в присутствии кальция и ГФИ-специфичной фосфолипазой С
4. Влияние сыворотки и ее компонентов на экспрессию рІЗО и Т-кадгерина
5. Локализация рІЗО и Т-кадгерина в клеточной мембране
ВЫВОДЫ
Список литературы

(Sigma) из расчета 100 мг антител на 1 мг иммобилизованного фермента. Инкубировали смесь в течение 3 часов в случае козьих IgG и 4 часов в случае кроличьих IgG с перемешиванием при 37°С. Инкубацию останавливали либо добавлением иодацетамида, либо центрифугированием и удалением осадка иммобилизованного папаина. Полученный препарат Fab-фрагментов анализировали методом ПААТ-электрофореза, диализовали против PBS и хранили при -20°С. Тем же способом получали Fab-фрагменты препарата кроличьих неиммунных IgG.
1.5. Получение конъюгатов синтетических пептидов с пероксидазой хрена.
Конъюгаты пептидов Т-кадгерина с пероксидазой хрена (ПХ) получали по следующей методике: 4 мг ПХ растворяли в 300 мкл раствора, содержащего 0,05 М ацетата натрия и 0,1 М хлорида натрия с рН=5,3. В раствор добавляли 14 мг сухого перйодата натрия, смесь инкубировали в темноте в течение 1 часа. Затем окисленную ПХ отделяли от низкомолекулярных компонентов гельфильтрацией (центрифугированием на колонке с Сефадексом G-25, уравновешенным 0ДМ карбонатным буфером с рН=8,2) и к полученному раствору добавляли по 1 мг пептида в 500 мкл 0,1М карбонатного буфера с рН=8,2. После 30 мин инкубации к растворам добавляли по 2,5 мг цианоборгидрида натрия и инкубировали при 4°С в течении ночи. Затем коньюгаты переводили в 10 мМ PBS гельфильтрацией (центрифугированием на колонке с Сефадексом G-25).
1.6. Получение поликлональных антител против пептидов Т-кадгерина.
1.6.1. Иммунизация кроликов