Моделирование старения на стационарных клеточных культурах

• Автор: Прохоров, Леонид Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1 . ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Использование стационарных клеточных культур для изучения старения
1.1.1. Сходство изменений параметров "стационарно стареющих" клеток с изменениями аналогичных параметров, происходящих при старении in vivo, а также при старении in vitro "по Хейфлику"
1.2. Клеточно - кинетическая модель
1.3 Изучение причин ограничения пролиферации клеток в культуре
1.4. Клональный анализ как метод исследования в клеточной геронтологии
1.5. Эксперименты по влиянию антиоксидантов на культивируемые клетки
1.5.1. Изучение влияния антиоксидантов на клетки с использованием "модели Хейфлика"
1.5.2. Изучение влияния антиоксидантов на клетки, находящиеся в стационарной стадии
1.5.3. Изучение влияния антиоксидантов на клетки с использованием клеточно-кинетической модели
1.6. Исследование содержания и активности цитохромов Р-450 (в том числе О-деалкилаз) в организме и в культивируемых клетках
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Используемые клетки и препараты
2.2. Культивирование клеток
2.3. Примененные способы клонирования клеток
2.4. Определение времени клонирования клеток
2.5. Математическое обеспечение работы
ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Исследование некоторых закономерностей роста и "стационарного старения" клеток, а также происходящих при этом изменений их
свойств и характеристик
3.1.1. Изменение числа живых трансформированных клеток китайского хомячка, а также их пролиферативной способности и уровня синтеза ДНК в них при росте, "стационарном старении" и последующей гибели этих клеток

в культуре
3.1.2. Изменение числа живых эмбриональных диплоидных фиброб-ластов человека, а также их пролиферативной способности и уровня синтеза ДНК в них при росте, "стационарном старении" и последующей гибели этих клеток в культуре
3.1.3. Сравнение "стационарного старения" нормальных и трансформированных клеток
3.1.4. Влияние периодической замены среды на рост и "стационарное старение" клеток
3.1.5. Влияние "возраста" среды на рост клеток
3.1.6. Корреляция некоторых параметров, связанных с пролиферативной активностью клеток, с продолжительностью жизни "стационарно стареющих культур" и с максимальной продолжительностью жизни млекопитающих
3.1.7. Некоторые дополнения к данным о связи пролиферации с продолжительностью жизни организмов и "стационарно стареющих" культур
3.1.8. Связь скорости пролиферации клеток с "общей и "стационарной " продолжительностью жизни культур трансформированных клеток китайского хомячка
3.1.9. Исследование параметров, связанных с ограничением пролиферации клеток
3.1.10. Математическая модель роста и "стационарного старения"
3.1.11. Распределение клеток по митотической активности и по фазам клеточного цикла после посева, при росте, переходе из логарифмической стадии в стационарную и на разных этапах стационарной стадии ("стационарного старения")
3.2. Влияние буферной емкости среды на кинетику роста и "стационарного старения" трансформированных клеток китайского хомячка
3.3. Исследование 0-деалкилазной активности некоторых цитохромов Р-450 с использованием модели "стационарного старения"
3.4. Влияние различных веществ и препаратов (в том числе геропро-текторов и геропромоторов) на эффективность клонирования, а также на рост и "стационарное старение" трансформированных клеток китайского хомячка и диплоидных фибробластов человека

3.4.1. Влияние эпигида (хлоргидрата 2-этил-б-метил-З-оксипи-
ридина)
3.4.2. Влияние дибунола (4-метил-2,б-дитретбутилфенола, или
бутилокситолуола)
3.4.3. Влияние анфена и глутатиона
3.4.4. Влияние Т-активина
3.4.5. Влияние холестерина и 7-кетохолестерина
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

(т.е. в 17 классах). По результатам строили графики изменения числа колоний из 16 и более клеток, а также графики зависимости среднего и максимального размеров колоний и их числа в разных классах от времени роста и "стационарного старения" клеток в культуре.
Чтобы оценить уровень синтеза ДНК в ядрах клеток культуру клеток засевали в ячейки (площадь ячейки 2 см ) планшетов (СоэФаг, США) в которые предварительно помещали покровные стекла размером 8x8 мм. Долю клеток, синтезирующих ДНК в исследуемых культурах, определяли на клетках, растущих на указанных покровных стеклах, методом радиоавтографии по включению 3Н-тимидина в ДНК ядер. 3Н-тимидин вносили в культуральную среду из расчета 5 мкКи/мл. По прошествии 3 часов клетки, растущие на покровных стеклах в среде с 3Н-тимидином, дважды промывали ФСБ и фиксировали 96%-ным этанолом в течение 10 мин. Высушенные покровные стекла наклеивали клетками вверх на предметные стекла энтелланом (Мегск, ФРГ). Через сутки полученные препараты обрабатывали 5%-м раствором трихлоруксусной кислоты в течение 5 мин при температуре +4° С и два часа промывали проточной водопроводной водой. После промывки препараты высушивали и покрывали расплавленной при 37° С фотоэмульсией типа "М" (Госни-ихимфотопроект) с помощью проволочной петли. После четырехсуточной экспозиции препараты проявляли амидоловым проявителем, содержащим 1,5 г 2,4-диаминофенолдигидрохлорида (амидола - Кобак, США), 5 г кристаллического сульфита натрия, 250 мг лимонной кислоты в 500 мл дистиллированной воды. Время проявления составляло 1,5 мин. Затем препараты фиксировали 40%-ным раствором тиосульфата натрия в течение 20 мин и промывали проточной водопроводной водой около 30 мин. Перед просмотром препаратов и подсчетом числа меченных 3Н-тимиди-ном ядер их окрашивали специально подобранным красителем, содержащим 1% метиленового синего, 1% толуидинового синего и 1% КНСО (Егоров, 1985). С помощью светового микроскопа на радиоавтографах считали число меченных 3Н-тимидином клеток среди 300 просмотренных. Процент меченых клеток определяли по формуле:

где -число меченых клеток; Ыр-общее число клеток; М-процент меченых клеток, синтезирующих ДНК.
Для определения поверхностной плотности клеток на препаратах использовали квадратную рамку (с видимой площадью 0,1024 мм2), которую помещали за окуляром микроскопа. Счет вели по пяти полям