Исследование функциональных характеристик и механизмов регуляции механочувствительных ионных каналов в клетках миелоидной лейкемии человека К562

• Автор: Старущенко, Александр Викторович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 92 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Классификация механочувствительных каналов

2.1.1. Свойства открытого канала проводимость и селективность

2.1.2. Воротные характеристики

2.2. Фармакологические подходы к изучению механочувствительных

каналов

2.2.1. Блокаторы механочувствительных каналов

2.2.2. Потенциальные активаторы механочувствительных каналов

2.3. Механочувствительные каналы и двухвалентные катионы
проницаемость, блокирование
2.4. Современные представления о возможной роли цитоскелета в
регуляции механочувствительных каналов
2.5. Механочувствительные каналы в прокариотах
3. Материалы и методы
3.1. Клеточная культура
3.2. Электрофизиология
3.3. Механическая стимуляция
3.4. Растворы
3.5. Обработка результатов
4. Результаты
4.1. Идентификация механочувствительных катионных каналов в
клетках миелоидной лейкемии человека
4.1.1. Эффект механической стимуляции участка плазматической
мембраны
4.1.2. Характеристика проводящих свойств
4.1.3. Селективность механочувствительных каналов
4.1.4. Исследование действия потенциальных блокаторов и активаторов
каналов
4.2. Кальциевая проницаемость и блокирование
механочувствительных каналов в клетках К
4.3. Проницаемость каналов для ионов магния
4.4. Влияние агентов, модифицирующих аппарат микротрубочек и
микрофиламентов, на свойства механочувствительных каналов в клетках К
4.4.1. Эффект цитохалазинов Д и Б
4.4.2. Исследование эффектов колхицина и нокодазола
5. Обсуждение
6. Выводы
7. Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
диметилсульфоксид i Р0 вероятность открытого состояния Рх проницаемость для иона X
I iv, i iiv активируемый положительным, но инактивируемый отрицательным давлением
iv, i iv активируемый и положительным, и отрицательным давлением
iv активируемый натяжением
I iiv инактивируемый натяжением
ВАХ вольтамперная характеристика
Е потенциал
Ерев. потенциал реверсии
мВ милливольт
мин минут
мм рт. ст. мм ртутного столба МЧ механочувствительный пА пикоампер
патчкламп метод локальной фиксации потенциала пСм пикосименс
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


В настоящее время механочувствительные ионные каналы обнаружены не только в специализированных механореценторных структурах, но также и в мембранах бактерий, грибов, растений, позвоночных и беспозвоночных животных. Роль механочувствительных каналов в специализированных механосенсорных клетках достаточно очевидна, в то время как во многих несенсорных клетках их функциональная значимость остается неясной. Существуют данные о том, что механочувствительные каналы вовлечены в контроль клеточного цикла, регуляцию объема и роста клеток i, i, , i, . В последние годы повышенный интерес вызывают исследования клеточных реакций, сопряженных с механической стимуляцией , Камкии и др. Сообщается об изменениях дифференцировки и деления клеток, экспрессии генов, секреции и эндоцитоза при действии механических сил различной природы i, i, . Предполагается, что механочувствительные каналы, наряду со структурами цитоскелета, иптегринами, некоторыми фосфолипазами и тирозинкиназами, играют существенную роль в процессах передачи сигнала при изменении механического состояния клетки , . Однако предположения относительно кальциевой проницаемости в основном опираются на данные косвенного характера, в то время как прямых измерений кальциевых токов и проводимости для механочувствительных каналов очень мало. Для клеток крови и эндотелия сосудов очевидна функциональная значимость реакций на механическое раздражение, что имеет место при колебаниях давления, скорости кровотока, как в норме при поддержании гомеостаза, так и при развитии патологических процессов. В то же время влияние механической стимуляции мембраны на одиночные каналы в клетках крови практически не изучено. Поэтому представляет интерес исследование ионных каналов, связанных с механочувствительностью клеток хронической миелоидной лейкемии человека К2, по своим свойствам являющихся аналогами стволовых клеток мультипотентных предшественников миелоидного ряда клеток крови. Цель настоящей работы заключалась в идентификации механочувствительных каналов плазматической мембраны клеток хронической миелоидной лейкемии человека К2, изучении функциональных свойств и возможных механизмов регуляции этих каналов. Исследовать возможность активации ионных каналов при механической стимуляции клеток К2. Определить проводимость и селективность механочувствительных каналов плазматической мембраны клеток К2. Исследовать возможную роль внеклеточного кальция в работе каналов оценить проницаемость механочувствительных каналов для ионов кальция в физиологическом диапазоне концентраций. Изучить влияние внеклеточных ионов магния на активность механочувствительных каналов, в частности, как потенциального блокатора иили проникающего катиона. Проверить действие известных фармакологических агентов потенциальных блокаторов и активаторов каналов. Изучить возможную зависимость активации, инактивации и свойств механочувствительных каналов от состояния субмембраииого цитоскелета. В плазматической мембране клеток миелоидной лейкемии человека К2 существуют ионные каналы, активирующиеся при механической стимуляции. Обнаруженные нами канаты обладают некоторыми свойствами значения проводимости одиночного канала, селективность, блокирование гадолинием и амилоридом, позволяющими высказать предположение, что они относятся к семейству катионселективных механочувствительных каналов. Механочувствительные каналы в клетках К2 проницаемы для ионов магния как при физиологических, гак и при более высоких концентрациях и для ионов кальция при физиологической внеклеточной концентрации. Функциональные характеристики каналов зависят от состояния микрофиламентов и, повидимому, не зависят от пересгроек в системе микротрубочек. В настоящей работе впервые были зарегистрированы катионные механочувствительные каналы в клетках хронической миелоидной лейкемии человека К2, охарактеризованы их проводящие и воротные свойства, кинетическое поведение и селективность, исследовано действие блокирующих агентов.