Разработка технологий получения препаратов природных и рекомбинантных белков из прокариотических клеток

• Автор: Лебедев, Леонид Рудольфович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Бердск
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Получение препаратов белков из
прокариотических клеток
Получение ферментов (эндонуклеаз рестрикции)
Способы анализа микроорганизмов на наличие эндонуклеазной активности
Способы выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции 8 Способы исследования субстратной специфичности ферментных препаратов
Получение рекомбинантных белков
Способы создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков
Способы получения и очистки рекомбинантных белков 28 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1 Выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикций и разработка технологии выделения и очистки ферментных препаратов
1.1.Выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции
1.2.Разработка способов повышения продуктивности штаммов по ферментам
1.3.Разработка технологии выделения и очистки эндонуклеаз рестрикции
1.4. Установление субстратной специфичности новых ферментов
2.Разработка технологии получения рекомбинантных белков
2.1.Изучение стабильности штаммов-продуцентов рекомбинантных белков и разработка способов повышения их продуктивности
2.2.Разработка технологии получения препаратов факторов некроза опухолей из растворимой
фракции клеток
2.3.Разработка метода получение белка (кандидата
в вакцины против ШУ-1) из нерастворимой фракции клеток (телец включения)
2.4 .Исследование свойств рекомбинантных белков
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
В современной биотехнологии проблемы получения функционально и химически чистых биологически активных веществ и анализ их биологических функций являются чрезвычайно актуальными на всех этапах разработки биопрепаратов, а отсутствие информации о физикохимических свойствах получаемых веществ и физиолого-биохимических особенностях микроорганизмов-продуцентов являются основным из сдерживающих факторов интенсификации микробиологического синтеза, выделения и применения биологически активных веществ. Изучение физиологии и биохимии продуцентов, как природного происхождения, так и рекомбинантных штаммов, необходимо для оптимизации питательных сред, условий культивирования и целенаправленного управления микробиологическим синтезом. Именно благодаря развитию и совершенствованию вышеперечисленного комплекса методов возможен дальнейший прогресс в развитии этой науки.
В последние годы, в связи с накоплением знаний по изучению связи между "архитектурой" и биохимическими свойствами белковых молекул, появилась возможность создания новых белков путем биосинтеза и клонирования искусственных генов. Наибольшие успехи достигнуты в работах с E.coli, которая стала центральным объектом исследований благодаря генетической изученности. Успешно для этих целей используются и другие микроорганизмы. Клетки микроорганизмов применяют, в частности, для биосинтеза и наработки таких важных полипептидов как цитокины, иммуномодуляторы, факторы роста, белки оболочек вирусов и многих других. Все эти микроорганизмы-продуценты созданы при помощи трансформации их рекомбинантными плазмидами, т.е. методами генетической инженерии.
Одним из основных моментов зарождения генетической инженерии было открытие сайт-специфических эндодезоксирибонуклеаз (эндонуклеаз рестрикции, рестриктаз). И дальнейшее развитие ведущих направлений биологической науки (молекулярно-генетических исследований и генетической инженерии, в частности) и ее прикладных аспектов, имеющих самое непосредственное отношение к решению биотехнологических проблем, во многом зависит от доступности широкого ассортимента рестриктаз различной субстратной специфичности.
Эндонуклеазы рестрикции являются одним из незаменимых инструментов при определении первичной структуры ДНК, создании рекомбинантных молекул ДНК, исследованиях генетического материала как природного, так и созданного искусственно.
Как при получении ферментов нуклеинового обмена (в частности -эндонуклеаз рестрикции), так и при получении биологически активных белков с использованием рекомбинантных ДНК, приходится решать комплекс проблем. С практической точки зрения процессы получения биологически активных веществ из прокариотических клеток можно разделить на ряд взаимосвязанных этапов:
а)поиск, селекция, создание штаммов-продуцентов БАВ, разработка методов и способов повышения их продуктивности в ходе культивирования штаммов и наработки биомасс;
б)разработка комплекса методов и способов извлечения целевых БАВ (в частности - белков) из клеток, выделения и очистки последних до необходимой степени чистоты (или до гомогенности);
в)характеристика получаемых препаратов по их функциональным свойствам.
Решение вопросов по каждому этапу, основанное на использовании последних достижений микробиологии, биохимии, генной инженерии и других наук, безусловно внесет существенный вклад в развитие биотехнологии и будет использовано для получения биологически активных веществ.
Сегодня биотехнология во всем мире рассматривается как самая перспективная с точки зрения практики область знаний. Проводятся опыты по созданию живых вакцин, создаются трансгенные животные, широко дискутируются вопросы о клонировании человека и т.д. Продолжающийся подъем биотехнологии постоянно требует устойчивого и полного обеспечения генно-инженерных, диагностических и др. работ ферментами обмена нуклеиновых кислот, и, в первую очередь, широким спектром эндонуклеаз рестрикции. Как следует из вышеописанного, они необходимы не только при создании генно-инженерных конструкций, но и для их дальнейшего контроля в ходе практического использования. Вследствие этого, поиск новых штаммов-продуцентов и разработка методов получения ферментов расширяют возможности вышеупомянутых работ.
Целью настоящей работы является выявление новых штаммов-продуцентов эндонуклеаз рестрикции, разработка комплекса приемов и методов, позволяющих получать из прокариотических клеток препараты белков как природного происхождения, так и рекомбинантных.
В задачу проведенных исследований входило развитие и оптимизация современных методов повышения уровня целевых белков в штаммах-продуцентах биологически активных веществ, процессов разделения и анализа биоорганических соединений.
Установлено, что важное значение при ренатурации имеет степень чистоты выделяемого полипептида.
Примеси могут препятствовать процессу ренатурации, образуя комплексы, а при наличии примесей протеаз в растворе, в процессе ренатурации произойдет деградация целевого белка и как следствие -его значительные потери. Поэтому, если не удается отмыть тельца включения от примесных белков до их растворения, проводят очистку полипептидов в присутствии некоторых растворителей до их ренатурации. Для этого обычно используют ионообменные хроматографии в присутствии мочевины. Гуанидинхлорид несет электрический заряд и препятствует процессу ионообменной хроматографии, но не препятствует проведению гель-фильтрации. Другие методы, используемые некоторыми авторами для очистки полипептидов перед их ренатурацией - это высокоскоростное центрифугирование, экстракция органическими растворителями и др.[179]. Так, в работе [240] авторы для извлечения интерферона-гамма использовали 50%-ный раствор пропанола и достигали на этой стадии выхода по целевому белку 39,6% при его очистке в 10 раз.
В процессе ренатурации белка одним из определяющих параметров является его концентрация, поскольку необходимо, чтобы
внутримолекулярные взаимодействия преобладали над межмолекулярными. В работах [240,241], при исследовании процесса ренатурации интерферона-гамма показано, что если при концентрациях белка ниже 0,3-0,5 мг/мл ренатурация проходит довольно успешно, то при концентрациях выше 0,3-0,5 мг/мл белок ренатурирует не полностью.
Особенно существенна концентрация белка в тех случаях, когда его молекулы содержат дисульфидные связи. В случаях разрушения дисульфидных связей в нерастворимых белковых включениях при использовании тиоловых реагентов или при образовании производных 8-сульфонатов, восстановление правильных дисульфидных связей
достигается применением смесей восстановленных и окисленных реагентов, таких как глутатион. Для этого подбираются оптимальные концентрации и соотношение восстановленного и окисленного
реагентов. При значении pH ренатурирующего буфера, равном 8,0 и выше, тиоло-дисульфидный обмен происходит быстро. При высоких значениях pH обмен тиоловых и дисульфидных групп может происходить и в отсутствии экзогенных тиоловых реагентов,
источником свободных тиоловых групп может служить сам белок [179].
Большое значение в процессе ренатурации имеет состав и концентрация буферов. В работах [240,241] авторы отмечали негативное влияние фосфатов и других двух-, трехвалентных кислотных остатков на восстановление нативной конформации интерферона-гамма.