Роль окиси азота (NO) в процессах пролиферации и дифференцировки клеток кроветворной ткани

• Автор: Радионова, Юлия Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.11
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ NO
1.2.ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА N0
1.3. ФЕРМЕНТ NO-СИНТАЗА
1.4. NO-СИНТАЗНЫЙ МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ NO
1.5. ФУНКЦИИ NO В РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ ОРГАНИЗМА МЛЕКОПИТАЮЩИХ
1.6. ДАННЫЕ ОБ УЧАСТИИ N0 В ПРОЦЕССАХ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2. 1. Экспериментальные животные
2. 2. NADPH-диафоразная реащия
2. 3. Иммуногистохимия
2. 4. Гистохимическая реакция выявления миелопероксидазы
2. 5. Экспериментальная модель
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. ИЗУЧЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТА NO-СИНТАЗЫ В РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЯХ И ОРГАНАХ МЫШЕЙ
3. 1. 1. Распределение фермента NOS в тканях и органах млекопитающих
3. 1. 2. Способы выявления локализации фермента NOS
3. 1. 3. NADPH-диафоразная реакция
3. 1. 4. Непрямая иммунофлуоресцентная реакция
3 .2. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ NO В КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ НА ПРИМЕРЕ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ

3. 2. /. Экспериментальна я модель. Ингибирование фермента NOS на модели Seki
3. 2. 2. Иммуногистохимический анализ клеток регенерировавшего костного мозга сингенных мышиных радиационных химер, инъецированных ингибитором фермента NOS
3.2.3. Морфологический анализ колоний на ацетат-целлюлозных мембранах сингенных радиационных мышиных химер в норме и при ингибировании фермента NO-синтазы
3.2.4. Обсуждение полученных результатов
ВЫВОДЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ № 1. ИЛЛЮСТРАЦИИ К РАБОТЕ
ПРИЛОЖЕНИЕ №2. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
1. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОГО
ТЕСТИРОВАНИЯ КЛЕТОК РЕГЕНЕРИРОВАВШЕГО КОСТНОГО МОЗГА
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время известно, что различные клетки млекопитающих способны при участии фермента NO-синтазы (NOS) синтезировать из L-аргинина оксид азота — NO (Palmer et al., 1987; Knowles, Moncada, 1994). Работами последних лет показано, что оксид азота N0 участвует в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток разного типа (Peunova, Enikolopov, 1995; Kuzin, Roberts, 1996; Holliday et al., 1997). Однако до сих пор детальный механизм этих процессов остается неясным. Изучение роли N0 в пролиферации и дифференцировке клеток кроветворной и других тканей является одним из важных аспектов, необходимых для понимания фундаментальных основ регуляции процессов детерминации и дифференцировки клеток.
Для того чтобы изучить, каким образом N0 влияет на дифференцировку и пролиферацию клеток кроветворной ткани, начиная с самых ранних сроков кроветворения, мы тестировали восстановившийся костный мозг радиационных мышиных химер в норме и в условиях ингибирования фермента NO-синтазы. Кроме того, используя модель Seki (модель получения кроветворных колоний на ацетат-целлюлозных мембранах, имплантированных в перитонеальную полость мышей, у которых разрушенное облучением кроветворение было восстановлено за счет внутрибрюшинного введения клеток донорского костного мозга (Seki, 1973; Мичурина и др., 1991)) мы изучили влияние ингибирования NO-синтазы на процесс образования колоний на АЦ-мембранах и их клеточный состав.
Цель настоящей работы состояла в том, чтобы на модели регенерирующей кроветворной ткани изучить участие окиси азота — N0 в регуляции процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток.

Разведение первых и вторых антител для всех случаев подбирали при помощи предварительного титрования.
2. 4. Гистохимическая реакция выявления миелопероксидазы.
Гистохимическая реакция на пероксидазу позволяет выявлять колонии, состоящие из зрелых гранулоцитов и предшественников моноцитов. Она основана на окислении бензидина перекисью водорода в присутствии фермента. (Bonati, Franchi, 1948; Van Duijn, 1955; Пирс, 1962).
Приготовление насыщенного р-ра бензидина: 1 мг бензидина растворяли в 25 мл. дистиллированной воды (20 мин. кипятить на водяной бане). После этого р-р фильтровали.
АЦ-мембраны (САМ), извлеченные из перитонеальной полости радиационных мышиных химер, отмывали в среде №199, затем фиксировали следующим фиксатором (9 частей 96% этилового спирта + 1 часть нейтрального формалина) при комнатной тем-ре (15 мин.). После удаления фиксатора САМ отмывали в дистиллированной воде (2 смены по 15 мин.). После отмывки САМ инкубировали в смеси следующего состава (10 мл. насыщенного раствора бензидина +5-10 мкл. 3% р-ра перекиси водорода) при комнатной тем-ре (10- 15 мин. до появления коричневой окраски). После удаления реакционной смеси АЦ-мембраны отмывали дистиллированной водой (4 смены по 5 мин.). После отмывки наносили на мембраны краситель (10 мкл. ГИМЗы + 1 мл. диет, воды) при 37°С (2-4 ч.).
После удаления красителя САМ отмывали в дистиллированной воде (5 мин) и в вертикальном положении высушивали (15 мин.). Затем, последовательно инкубировали САМ в 96% этиловом спирте (15 мин.), абсолютном этиловом спирте (2 смены по 20 - 30 мин.), ортоксилоле (2 смены по 15 мин). После чего АЦ-мембраны располагали на