Участие тирозиновой протеинфосфатазы SHP-1 в передаче сигнала от рецептора инсулина

• Автор: Кривцов, Андрей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. РОЛЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ТИРОЗИНОВЫХ ОСТАТКОВ В КЛЕТОЧНОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ
2. БЕЖИ УЧАСТВУЮЩИЕ В СИГНАЛИЗАЦИИ ОТ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ
2.1. Рецепторы ростовых факторов
2.2. Рецепторы PDGF и EGF
2.3. Рецептор ршсулина
2.3.2. Уникальность инсулиновой сигнализации
2.4. Сигнальные белки, расположенные «ниже» рецептора инсулина. МАР киназный путь
2.4.1. SH2 домены или SH2 содержащие белки
2.4.2. Адапторный белок She (Src Homology / Collagen)
2.4.3. Комплекс Grb2/SOS
Активация MAP киназы
2.5. Участие IRS-1 в инсулиновой сигнализации и путь Р13-киназы
2.5.1. Идентификация IRS- белков
2.5.2. TRS- белки координируют разветвленную и гибкую сигнальную систему
2.5.3. Сигнальные белки, взаимодействующие с IRS
2.6. Р13-КИНАЗА И РОЛЬ IRS-1 В ЕЁ АКТИВАЦИИ. Р13-КИНАЗНЫЙ ПУТЬ
2.7. ТИРОЗИНОВЫЕ ПРОТЕИНФОСФАТАЗЫ S11P-! И SHP
2.7.1. SHP-1 в гематопозтических клетках
2.7.2. S11P-1 и SHP-2 и Т-клеточная сигнализация
2.8. IRS-1 АКТИВИРУЕТ ФОСФАТАЗУ SHP
2.9. Ингибирование сигнализации через IRS
2.10. Семейство белков SIRPa
3. СИНТЕЗ ГЛИКОГЕНА И РОЛЬ ГЛИКОГЕНСИНТЕТАЗЫ В СИНТЕЗЕ ГЛИКОГЕНА
3.1. Активация синтеза гликогена инсулином
3.2. Судьба глюкозы в организме
3.3. Стадии, определяющие скорость синтеза гликогена
3.4. Механизм активации гликогенсинтетазы
3.4.1. Дефосфорилирование гликогенсинтетазы приводит к ее активации
3.4.2. Передача инсулинового сигнала на гликогенсинтетазу
3.5. Инактивация инсулином киназы, фосфорилирующей ГС
3.6. Другие сигнальные пути, которые могут участвовать в регуляции ГС
РЕЗЮМЕ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований
2.1.2. Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований
2.1.3. Реактивы и материалы для иммунохимических исследований
2.2. ЭКСПРЕССИОННЫЕ ПЛАЗМИДЫ
2.3. Праймеры и пептиды
2.4. Клеточные линии
2.5. Культивирование клеток
2.6. Стимуляция клеток лигандами, обработка вортманнином, конканавалином и
ПЕРВАНАДАТОМ, ЛИЗИС КЛЕТОК
2.7. ИММУТТОПРЕТЩТТИТА1 (ИЯ
2.8. Электрофорез в ПААТ в присутствие ДСП и
2.9. ИММУНОБЛОТТИНГ (ВЕСТЕРН БЛОТТИНГ)
2.10. Транзиторная гиперэкспрессия
2.11. Стабильная гиперэкспрессия
2.12. Определение активности фосфатидилинозитол-3 ’ киназы
2.13. Измерение активности гликогенсинтетазы
2.14. Измерение включения [3Н] тимидина в ДНК
2.15. Определение пролиферации по включению МТТ
2.16. Измерение транспорта [3Н]-глюкозы в клетку
2.17. Измерение фосфатазной активности
2.18. Мутагенез in vitro
2.18.1. Получение одно цепочечной ДНК
2.18.2. Отжиг праймеров и построение цепи ДНК, содержащей мутацию
2.18.3. Лигирование цепи ДНК, содержащей мутацию
2.19. Выделение плазмидной дик
2.20. Определение нуклекотидной последовательности ДНК
2.20.1. Щелочная денатурация ДНК
2.20.2. Отжиг праймера
2.20.3. Сиквенсная реакция
2.21. Ферментативное деглжозилирование белков
2.22. Мечение клеток [3Н] глюкозамином и выделениие ГФИ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Сравнительная характеристика связывания SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста, EGF, PDGF и инсулина
3.1.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором EGF
3.1.2. Связывание Si IP-1 и SHP-2 с рецептором PDGF
3.1.3. Связывание SHP-1 и SHP-2 с рецептором инсулина
3.2. Связывание SHP-1 с субстратом рецептора инсулина-1RS
3.2.1. Связывание SHP-1 и SHP-2 cIRS-1 в клетках BHK-IR
3.2.2. Связывание эндогенных SHP-1 с 1RS-] в клетках IM9
3.2.3. Картирование SH2 домена SHP-1, участвующего в связывании с IRS
3.2.4. Взаимодействие IRS-1 с SHP-1 в клетках Rati
3.2.4.1. Дефосфорилирование IRS-1 фосфатазой SHP-1 в клетках Rati
3.2.4.2. Сравнительная характеристика 1RS-1 - зависимой активации Р1:,-киназы в клетках Rati, экспрессирующих каталитически активную и не активную SHP
3.3. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на биологические ответы клеток RatI, вызванные инсулином
3.3.1. Активация гликогенсинтетазы
3.3.2. Синтез ДНК
3.3.3. Клеточная пролиферация
3.3.4. Регуляция инсулин-зависимой активации фосфолипазы С, специфичной в отношении ГФИ в клетках Rati
3.3.4.1. Инсулин стимулирует расщепление ГФИ в Rati клетках
3.3.4.2. Инсулин активирует ГФИ специфичную фосфолипазу С
3.3.4.3. Инсулин-зависимая активация ГФИ специфичной фосфолипазы С чувствительна к вортманнину
3.4. БЕЛОК SIRPa - СУБСТРАТ ФОСФАТАЗЫ SHP
3.4.1. Предпосылки к изучению взаимодействия SHP-1 с SIRPa
3.4.2. Связывание SHP-1 с SIRPa
3.4.3. Активация SHP-1 фосфопепгидами SIRPa
3.4.6. SIRPa как субстрат для SHP
3.4.6.1. Изучение взаимодействия SHP-1 и SIRPa с помощью синтетических пептидов SIRPa
3.4.6.2. Картирование SH2 домена SHP-1, опосредующего связывание с SIRPa
3.5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SHP-1 -белка SIRPa
3.5.1. Кросс-сшивка SIRPa с помощью антител не вызывает его тирозиновое фосфорилирование
3.5.2. SIRPa образует устойчивые кластеры
3.5.3. Влияние SIRPa на метаболические эффекты инсулина
3.5.3.1. Транспорт глюкозы
3.5.3.2. Активация гликогенсинтетазы
3.6. КОНТРОЛЬ УРОВНЯ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ SHP
3.6.1. SHP-1 обладает способностью к аутодефосфорилированию
3.6.2. Димеризация SHP
3.6.3. Поиск адаптора, на котором могут образовываться димеры SHP
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Взаимодействие SHP-1 и SHP-2 с рецепторами факторов роста
2. Аутодефосфорилирование SHP-1 КАК процесс, контролирующий уровень ШРОЗИНОВОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ этой фосфатазы
3. Участие фосфатазы SHP-1 в регуляции уровня тирозинового фосфорилирования IKS
3.1. Участие инозитолфосфогликана в инсулиновой сигнализации
4. Влияние стабильной экспрессии SHP-1 на мтггогенные эффекты инсулина
5. Структурные и функциональные свойства нового субстрата фосфатазы SHP-1 -белка SIRPa
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

3.5. Инактивация инсулином киназы, фосфорилирующей ГС
Уровень серинового фосфорилирования ГС можно снизить путем как активации сериновых протеинфосфотиз, дефосфорилирующих ГС, так и за счет ингибирования сериновых протеинкиназ, фосфорилирующих ГС. Какие сериновые протеинкиназы ответственны за фосфорилирование ГС in vivo и подавляет ли инсулин их активность? Были идентифицированы несколько киназ, фосфорилирующих ГС in vitro [Skurat et al., 1996;
Cohen et al., 1986; Roach et al., 1991], однако было неясно, какая из этих сериновых протеинкиназ фосфорилирует ГС in vivo.

PI -киназа

Rho85 ГОМОЛОГ
PKA/CK-I
|yrc

Grb2/SOS

Ras/Raf

МАР-киназа

4 Другая сигнализация
Рисунок 4. Схема регуляции ГС инсулином.
Киназа-3 гликогенсинтетазы (GSK-3) фосфорилирует сайты 4, Зс, ЗЬ и За in vitro только в том случае, если до этого сайт 5 был уже фосфорилирован казеин киназой-П [Roach, 1991]. Зависимость от предшествующего серинового фосфорилирования для функционирования некоторых киназ было названо «иерархическим» фосфорилированием [Roach, 1991]. Как было сказано ранее, фосфорилирование по сайтам За и ЗЬ является потенциально инактивирующим [Skurat et al., 1996; Cohen et al., 1986; Roach et al., 1996], и было показано, что инсулин вызывает снижение активности GSK-3 в нескольких типах клеток [Hughes et al., 1993; Welsh et al., 1993]. Существует доказательство, что ингибиторный эффект инсулина на GKS-3 опосредуется киназой РКВ, которая может фосфорили-ровать и инактивировать GSK-3 in vitro [Cross et al., 1995]. Оказалось, что in vitro PKB фосфорилирует те же сайты в GSK-3, которые фосфорилируются в ответ на действие