Глутаминсинтетаза мозга человека в норме и при шизофрении

• Автор: Терешкина, Елена Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 97 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

Список использованных сокращений.

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Метаболическая связь нейронов и астроцитов

Автономный метаболизм глутамата в мозге. Астроциты синтезируют углеродный скелет глутамата,

используемый нейронами

Поглощение глиальными клетками глутамата,

высвобожденного нейронами.

Глутаматглутаминовый цикл с участием

нейронов и глиальных клеток.

Пути превращений глутамата в мозге
Синтез глутамата в нейронах
цитозольномитохондриальный шаттл.
Другие пути биосинтеза глутамата
Утилизация глутамата в астроцитах.
Глутаминсинтетаза ГС
Биохимические свойства и
сведения о структуре ГС.
Функции ГС в нервной системе
Выводы о функциональной роли ГС на основе результатов
по ингибированию ГС в экспериментах на животных
Защитная функция ГС
Множественность генов ГС человека,
локализация известных генов и псевдогенов ГС
Регуляция экспрессии ГС млекопитающих
в ходе дифференцировки и развития нервной ткани.
Регуляция экспрессии гена ГС гормонами
на уровне транскрипции.
Регуляция экспрессии гена ГС вторичными мессенджерами.
Регуляция уровня ГС возбуждающими аминокислотами
Цитоспецифическая экспрессия гена ГС
и ее контроль в ходе развития
Регуляция экспрессии ГС в зрелом организме
и тканях модели.
Изменения уровня ГС как реакция на стресс
Регуляция активности ГС на посттранскрипционном
уровне. Пострансляционные модификации ГС.
ГС при патологических процессах в ЦНС.
Экспериментам ьные модел и.
ГС и изменения метаболизма глутамата
при патологиях нервной системы человека
ГС и цикл ГлуГпн при болезни Альцгеймера
Инактивация и снижение иммунореактивности ГС
при окислительных модификациях.
Изменение клеточной локализации ГС при болезни
Альцгеймера иммуноцитохимические данные
Глутаматергическая система при шизофрении.
Патологические изменения астронитов при шизофрении
Гипоглутаматергическая гипотеза шизофрении
Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Материалы.
Получение экстрактов белков мозга.
Определение ферментативной активности ГС
Определение концентрации белка
Определение частичной аминокислотной
последовательности ГС и ГСПБ
Хранение очищенных ферментов
Ионнообменная хроматография.
Г ельфильтрация
Аффинная хроматография
Электрофорез в ДСИаПААГ.
Двумерный электрофорез
Иммуноферментный метод анализа
Вестерниммуноблоттинг с
хемилюминесцентным усилением сигнала
Статистическая оценка данных
Получение антисывороток и их тестирование.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ
Выделение глутаминсинтетазы и белка,
подобного глутаминсинтетазе, из мозга человека
Влияние различных факторов на ферментативную
активность ГС и ГСПБ
Определение молекулярной массы ГС и ГСПБ,
молекулярной массы и ИЭТ их субъединиц
Определение частичной аминокислотной последовательности
ГС и ГСПБ.
Получение поликлональных антител к ГС и ГСПБ
Сравнительное изучение ферментативной активности
и иммунореактивности ГС и ГСПБ в различных областях
мозга в норме и при шизофрении
V. ОБСУЖДЕНИЕ.
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
I. ВВЕДЕНИЕ.
Актуальность


Образовавшийся Глн может захватываться глутаматергическими нейронами, в которых под действием фосфатактивируемой глутаминазы превращается в Глу и пополняет нейромедиаторный пул. Таким образом, ГС играет центральную роль в функционировании глутаматглутаминового цикла в нервной системе. Известно, что нарушения метаболизма Глу играют важную роль в развитии ряда патологических процессов в нервной системе. Увеличенный уровень Глу в нервной ткани, как предполагается, является причиной гибели нейронов изза высокой токсичности Глу . При таких тяжелых патологиях как эпилепсия, болезнь Альцгеймера, шизофрения наблюдаются изменения функционирования компонентов глутаматергической нейромедиаторной системы. Показано, что при шизофрении происходит снижение концентрации Глу в спинномозговой жидкости и в отдельных областях мозга например, лобной коре и гиппокампе 2. Сформулирована гипоглутаматергическая гипотеза о том, что нарушение глутаматного нейромедиаторного пути играет роль в гтагогеиезе шизофрении. Эта гипотеза была основана на таких фактах, как изменение экспрессии генов компонентов глутаматергической системы рецепторов и переносчиков глутамата при шизофрении. Глу в первую очередь глутаминсинтетазы, глутаматдегидрогеназы и фосфагактивируемой глутаминазы. Это предположение было выдвинуто в лаборатории нейрохимии НЦПЗ и уже получены данные об изменении уровня глутаматдегидрогеназы в мозге при шизофрении . В литературе имеются данные относительно участия глутаминсинтетазы в патологических процессах в нервной ткани вследствие нарушения регуляции уровня глутамата. Второй субстрат глутаминсинтетазы, аммоний, хотя и является нормальным побочным продуктом метаболизма мозга, токсичен для нейронов в высоких концентрациях. В мозге и крови больных сенильной деменцией Альцгеймеровского типа и болезнью Альцгеймера обнаружен повышенный уровень аммония, хотя данные об изменении активности и содержания ГС в мозге при болезни Альцгеймера противоречивы , , , , , 3. Появление при болезни Альцгеймера и отсутствие в норме глутаминсинтетазы в спинномозговой жидкости, а также измененный уровень активности дают возможность считать глутаминсинтетазу потенциальным ранним прижизненным диагностическим маркером этого заболевания , 3. Таким образом, данные литературы свидетельствуют об изменении активности глутаминсинтетазы при различных поражениях мозга болезни Альцгеймера, ишемии мозга в исследованиях на животных. Однако, при шизофрении глутаминсинтетаза не изучалась. В связи с гипоглутамагергической гипотезой патогенеза шизофрении изучение глутаминсинтетазы при этом заболевании представляется актуальным. Цель и задачи исследования. Целью данной работы является оценка возможного участия глутаминсинтетазы ГС в нарушении метаболизма глутамата при шизофрении. Выделение ГС из ткани мозга лиц, не страдавших психическими или неврологическими заболеваниями. Характеристика физикохимических свойств ГС. Сравнительная оценка уровня активности ГС в экстрактах различных областей мозга человека в норме и при шизофрении. Получение поликлональных антител к ГС мозга человека. Разработка способа определения содержания ГС с использованием полученных антител. Сравнительное изучение содержания ГС в мозге в норме и при шизофрении. Научная новизна работы. В работе предложен метод выделения ГС из мозга человека, позволяющий увеличить выход фермента по сравнению с методами, известными по данным литературы 3, 0. Впервые в мозге обнаружен и выделен белок, подобный ГС по ферментативной активности и иммунореактивности, названный белком, подобным глутаминсинтетазе ГСПБ. Установлено, что трансферазная активность ГС, измеряемая в экстрактах ткани мозга, являегся суммарной активностью ГС и ГСПБ. Охарактеризованы биохимические свойства ГС мозга человека и впервые ГСПБ. Молекулярная масса и ИЭТ субъединиц ГС и ГСПБ различны 1 кДа, ИЭТ 6,46,7 для ГС и 1 кДа, ИЭТ 5,96,2 для ГСПБ. I л . , от концентраций ионов Мп и М определены Кт для глутамина изучено влияние ингибитора БметионинБсульфоксимина в различных концентрациях на скорость ферментативной реакции.