Спектроскопия ЯМР высокого разрешения в изучении молекулярного механизма действия лекарственных препаратов

• Автор: Польшаков, Владимир Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 52 с. : ил.; 20х15 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы
Медицинская химия стоит на пороге качественных изменений - переходе от стратегии поиска новых лекарственных соединений методом скрининга к рациональным подходам, основанным на знании структуры потенциальной мишени действия. Завершение работы по расшифровке генома человеха, происходящее в наши дни, создает реальные предпосылки для установления многих новых мишеней действия лекарственных препаратов. Число биомншеыей в ближайшие годы может возрасти на порядок. В этой связи неизбежно возрастет значимость структурных исследований и вычислительных методов, используемых для поиска оптимальной структуры ингибитора фермента или лиганда, взаимодействующего с рецептором. Эффективность таких подходов основана на достижениях современной биохимии и молекулярной фармакологии, в том числе понимании факторов, контролирующих специфичность связывания лиганда с биомолекулой, а также знании путей биотрансформации препарата в организме. Несмотря на огромный объем знаний, накопленный в данной области, многие вопросы до сих пор еще остаются невыясненными. Недостаточно изучены особенности гидрофобных и кулоновских взаимодействий, и водородных связей, определяющих сродство биомишени к тому или иному лиганду, влияние динамических свойств биоМолекул на их способность связывать низкомолекулярные соединения.
Спектроскопия ЯМР служит одним из важнейших инструментов для изучения строения молекул и механизмов протекания химических процессов. Быстрое развитие методов ЯМР в последние годы сделало возможным определять трехмерную структуру в растворе сравнительно больших биологических объектов (до 30-40 хДа). Важным обстоятельством служит тот факт, что спектроскопия ЯМР предоставляет чрезвычайно широкий диапазон информации об изучаемых объектах - строении и электронных свойствах молекул, специфических внутри- и межмолекулярных взаимодействиях, динамических свойств молекул в широкой шкале времени. Спектроскопия ЯМР используется и для решения проблем биохимии, молекулярной биологии и молекулярной фармакологии. Методами ЯМР могут быть исследованы превращения лекарст-,4ных соединений, установлено строение продуктов их связывания с биомолекулами, изучены динамические свойства образующихся комплексов, исследованы специфические взаимодействия между препаратом и биомолекулой. В этой связи, представлялось необходимым разработать целостный подход к решению некоторых сложных вопросов молекулярной фармакологии с применением методов ЯМР.
Одной из нерешенных до настоящего времени проблем было установление молекулярного механизма действия оригинальных противоопухолевых препаратов -производных диспиротрипиперазиния. Биологические особенности действия резко отличали их от большинства известных ал ки пирующих агентов. Поэтому', предстояло решить вопрос о том, имеют ли указанные соединения свойства алкилирующих препаратов и каковы в этом случае их потенциальные мишени. Представлялось необходимым установить биологическую роль фрагмента диспиротрипиперазиния и терминальных остатков в указанных препаратах. Крайне важной представлялась также информация о путях биотрансформации соединений этого класса.
Другой проблемой, детально рассмотренной в работе, было установление факторов, контролирующих высокую специфичность связывания антифолатных препаратов с мишенью их действия - дигидрофолатредуюгазой. Этот фермент находится в фокусе интенсивных исследований, проводимых несколькими научными группами в мире, но до настоящего времени остается немало нерешенных вопросов, касающихся связывания с ним лекарственных соединений. Так, например, не были установлены факторы, контролирующие селективность связывания антибактериального препарата тримето-прим с бактериальной формой фермента. Не было найдено объяснения различия в специфичности связывания восстановленной и окисленной форм кофермента НАДФ с ДГФР. Не были решены и ряд других вопросов, важных для рационального поиска новых, более эффективных антифолатных препаратов. Указанные обстоятельства обуславливали актуальность проводимого исследования.
Цель работы
Целью настоящей работы являлась разработка подходов, направленных на эффективное использование новейших достижений спектроскопии ЯМР высокого разрешения для решения проблем молекулярной фармакологии и биохимии. В их числе были вопросы механизма биотрансформации лекарственных препаратов, их аэаимо-I действия с потенциальными биологическими мщпенями, определение структурных и
у динамических факторов, контролирующих процессы связывания лиганда с биомоле-

6. Установлена структура высокого разрешения для комплекса ДГФР с антибактериальным препаратом триметоприм и НАДФ-Н, в котором лиганды обладают высоким кооперативным эффектом связывания. Показано, что в основе кооперативного эффекта лежат специфические взаимодействия, прежде всего гидрофобного характера, между триметоксифенильной группой триметоприма, никотинамидным циклом НАДФ-Н и аминокислотными остатками белка, расположенными в центре связывания лигандов.
7. Изучены движения препаратов триметоприм и триметрексат в центре их связывания с ДГФР. Определены кинетические и термодинамические параметры процесса переворота триметоксифенильного цикла препаратов в ряде их комплексов. Установлено наличие коррелированных движений триметоприма и восстановленной формы кофермента НАДФ-Н. Высказана гипотеза о вкладе коррелированных движений лигандов в кооперативный эффект их связывания с белком. Аналогичный вывод о важной роли коррелированных движений сделан и на основании изучения электростатического взаимодействия карбоксильных групп метотрексата и дигидрофолата с положительно заряженным остатком Лга-57.
8. Изучены динамические свойства белка в ряде комплексов I. са$е ДГФР. Показано, что связывание лигандов с ферментом вызывает значительные изменения в мобильности белка, в особенности в медленной (от 10° до 103 сек) шкале времени. Установлена корреляция между изменением динамических свойств белка при переходе от апо-формы к комплексу и прочностью связывания лиганда. Предложена модель, объясняющая указанное явление.
9. Разработан подход для изучения электростатических взаимодействий и водородных связей между лигандом и белком, основанный на сочетании возможностей спектроскопии ЯМР и квантово-химических методов расчета. Изучена геометрия и энергетические параметры взаимодействия антифолатных препаратов с карбоксильной группой Азр-26 и НАДФ с атомами белкового остова ДГФР. В последнем случае показано изменение ориентации никотинамидного фрагмента НАДФ по отношению к белку при переходе от восстановленной к окисленной форме кофермента. Рассмотрена возможная роль указанного эффекта в изменении прочности связывания двух форм НАДФ с ферментом.