Ферментативный синтез искусственного гена пептида сна

• Автор: Власов, Виктор Петрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 147 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ ГЕНОВ литературный обзор

ФЕШЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННОГО ГЕНА ПЕНГВДА СНА обсуждение результатов. .

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Г.Кораны, который начал исследования в этой области еще в середине х годов , а к году осуществил первый полный синтез искусственного гена . Суть олигонуклеотидного синтеза сводится к постепенному наращиванию цепи путем постадийного присоединения к ней мононуклеотидов ступенчатый метод. При синтезе более чем 34звенных олигонуклеотидов возникают трудности при разделении продуктов реакции, поэтому в качестве присоединяемого компонента используется ди или тринуклеотид блочный метод. Гн1 о нуклеозидный В практике синтеза олигонуклеотидов широко использовались два основных приема образования межнуклеотидной связи фосфодиэфирный А и фосфотриэфирный Б методы. В первом методе нуклеотидным компонентом является монозамещенный фосфат, а образующееся в результате реакции соединение представляет собой диэфир фосфорной кислоты отсюда название метода синтеза. В случае триэфирного метода в реакцию вводится нуклеотидный компонент, в котором фосфатный остаток находится в форме диэфира, а образующаяся межнуклеотндная группировка является триэфиром фосфорной кислоты. Наиболее распространенным способом проведения синтеза как в диэфирном, так и в триэфирном методе является синтез в растворе. В качестве носителей используются инертные нераотвориыые полимеры. Суть метода состоит в том, что нуклеотидный или нуклеозидный компонент закреплен ковалентно на нерастворимом специально модифицированном полимере, а все остальные компоненты находятся в растворе. После проведения конденсации на твердой фазе уже оказывается олигонуклеотид, который легко может быть отделен от остальных продуктов реакции. Использование твердофазного метода резко сокращает время синтеза и облегчает выделение целевых олигонуклеотидов. Простота операций при работе с полимерным носителем позволяет использовать любые избытки реагентов и затем регенерировать их, а также повторять обработку иммобилизованных молекул. Очевидно, что кроме увеличения общей скорости синтеза твердофазный метод является единственным подходом, где возможна стандартизация всех операций, что позволяет автоматизировать процесс. Первым среди искусственных генов был синтезирован ген аланиновой тРНК дрожжей . Эта работа, выполненная Х. Г.Кораной с группой сотрудников, велась более 5 лет. С г. X7 г. Кораной были синтезированы два икозануклеотида, соответствующие участку дрожжевой аланиновой тРНК. . . В ходе синтеза этих икозануклеотвдов стало ясно, что получить достаточно протяженные фрагменты ДНК, такие, как ген тЕНК, чисто химическими методами вряд ли удастся. ДНКлигазы полинуклеотидлигазы, осуществляющего восстановление межнуклеотидных связей в нативных ДНК . Первой областью применения ДНКлигазы стали исследования Кораны по выяснению минимальной длины комплементарных олигонуклеотидов, сшиваемых лигазой. Оказалось, что сшиваемые олигонуклеотиды могут быть достаточно короткими 8звенными, кроме того, было отмечено участие в лигазной реакции 4звенного олигонуклеотида. Таким образом, открытие ДНКлигазы и первые опыты по ее применению показали, что этот фермент позволяет получать длинные цепи ДНК из коротких химически синтезированных олигонуклеотидов, объединенных в комплементарные комплексы. В ходе синтеза структурного гена аланиновой тРНК дрожжей Кораной была сформулирована трехэтапная стратегия получения двуспиральной ДНК. Первый этап представляет собой химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов, соответствующих обеим целевым нитям. Олигонуклеотиды должны содержать свободные концевые 3 и 5гидроксильные группы и представлять в сумме двунитевой фрагмент ДНК. Фрагменты, принадлежащие противоположным нитям, должны перекрываться 48 нуклеотидами. Рмеченные соединения, что значительно облегчает анализ продуктов сшивки. На третьем этапе проводят сшивание с помощью ДНКлигазы двух или большего числа олигонуклеотидов. Для этого короткие фрагменты ДНК с перекрывающимися комплементарными последовательностями смешиваются при определенной ионной силе и температуре и образуется двухцепочечный комплекс.