Роль мембранных рецепторов лимфоцитов в патогенезе ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека ex vivo

• Автор: Малькевич, Нина Владиславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава I. Обзор литературы
1.1. История открытия ВИЧ и гипотезы его происхождения
1.2. Глобальная пандемия ВИЧ
1.3. Классификация ВИЧ и распространение субтипов
1.4.Структурная и геномная организация ВИЧ
1.4.1. Структура ВИЧ
1.4.2. Геном ВИЧ
1.5. Сравнительная характеристика ВИЧ-1 и ВИЧ
1.6. Механизмы узнавания и проникновения в клетки -мишени
1.7. Внутриклеточная трансфомация
1.8. Способы передачи ВИЧ и клинические признаки болезни
1.8.1. Способы передачи ВИЧ
1.8.2. Клинические признаки болезни
1.8.2.а. Острая фаза инфекции
1.8.2.б. Прогрессирование болезни
1.9. Цитопатический эффект ВИЧ-1 на клетки и ткани иммунной системы
1.9.1. Лимфатическая ткань человека - это основное место размножения ВИЧ
1.9.2. СВ4+ Т-лимфоциты - это клетки-мишени для ВИЧ
1.9.3. Роль С08+ Т-лимфоцитов в ВИЧ-1 инфекции
1.9.4. Влияние ВИЧ-1-инфекции на В-лимфоциты
1.10. Программируемая смерть клетки (апоптоз) - как механизм гибели Т-лимфоцитов при ВИЧ-1-инфекции
1.10.1 Общая характеристика апоптоза и некроза
1.10.2. Роль апоптоза в инфекции ВИЧ
1.10.3. Проблематика изучения патогенеза ВИЧ
Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОД Ы
2.2.1. Гисто культура лимфатической ткани человека
2.2.2. ВИЧ-1 и заражение гистокультур вирусом
2.2.3. Измерение вирусной репликации методом «ELISA»
2.2.4. Метод проточной цитометрии
2.2.5. Метод подсчета абсолютного числа клеток «TRUCOUNT»
2.2.6. Анализ размножения клеток
2.2.7. Определение апоптоза
2.2.8. Процедура стимуляции CD8+ Т-лимфоцитов
2.2.9.Определение генотипа A32CCR5 лимфатической ткани
2.2.10. Использование ингибиторов
2.2.11. Анализ экспериментальных данных
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Вирус Иммунодефицита Человека вызывает апоптоз в CD4+, но не
в CD8~ Т-лимфоцитах в лимфатической ткане инфицированной ex vivo
3.1.1. Обоснование исследования
3.1.2.Анапиз размножения ВИЧ-1 в гистокультурах
3.1.3.Анализ количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в тканях,
инфицированных SF162 и LAV
3.1.4.Динамика изменения числа CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в ЬАУ.04-инфицированных тканях
3.1.5. Анализ количества В-лимфоцитов в контрольных и
LAV. 04 - инфицированных тканях
3.1.6. Увеличение апоптоза в CD4+ Т-лимфоцитах в тканях, зараженных

3.1.7. Кинетика увеличения апоптоза в процессе инфекции
3.1.8. Анализ апоптоза в субпопуляциях CXCR4+/CD4+ и CCR5+/CD4+ лимфоцитов
3.1.9. Размножение CD4* и CD8+ Т-лимфоцитов

3.1.10. Проверка функциональности CD8+ Т-лимфоцитов
3.2. Гибель CD4" Т-лимфоцитов и использование корецепторов Х4, R5 и R5X4 вариантами ВИЧ
3.2.1. Обоснование исследования
3.2.2. Выявление A32CCR5 гомозиготной ткани
3.2.3. Специфичность корецепторного использования R5X4 вариантов ВИЧ-1 62 3.2.4 Чуствительность R5X4 вариантов ВИЧ-1 к ингибированию CCR5
CXCR4- корецепторов специфическими лигандами
3.2.5. Цитопатическое воздействие R5X4 ВИЧ-1 изолятов на CD4' Т-лимфоциты в A32CCR5 и нормальной лимфатической ткани
3.3. Цитопатический эффект субтипов А, С, Е ВИЧ-1 в лимфатической ткани человека
3.3.1. Обоснование исследования
3.3.2. Цитопатический эффект на CD4' Т-лимфоциты Х4 и R5 вариантов
ВИЧ-1 субтипов А, С, Е в лимфатической ткани, инфицированной ex vivo
Глава 4. Обсуждение результатов
Глава 5. Заключение
Глава 6. Выводы
Глава 6. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 2. Материалы и методы исследования.
гл. МАТЕРИАЛЫ.
Кусочки лимфатической ткани культивировали в культуральных плашках (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ), на коллагеновых гелях (Pharmacia and Upjohn, Kalamazoo, MI). Использовали следующий состав среды: RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NJ), эмбриональная телячья сыворотка (SUMMIT Biotechnology, Fort Collins, CO), пеницилин/стрептомицин (Gibco BRL, Grand Island, NJ), гентамицин (Gibco BRL, Grand Island, NJ), фунгизон (Gibco BRL, Grand Island, NJ). Жизнеспособность клеток определяли с помощью трипанового синего (BioWhittaker, Walkersville, MD).
Клеточную суспензию после изолирования из ткани разбавляли PBS (Gibco BRL, Grand Island, NJ). Клетки окрашивали следующим набором антител : анти-СОЗ (Caltag, Burlingame, СА), анти CD4 (Caltag, Burlingame, СА), aHTH-CD8 (Caltag, Burlingame, CA), анти CD45 (Caltag, Burlingame, СА), анти-CD 19 (Caltag, Burlingame, CA), anra-CCR5 (BD Pharmingen, San Diego, С А), анти-СХСЯ4 (BD Pharmingen, San Diego, CA), [IFN-y]-PE (Coulter Immunotech, Marseille, France), [TNF-a]-PE (Coulter Immunotech, Marseille, France), [IL-2J-PE (Coulter Immunotech, Marseille, France). Апоптоз определяли методом окраски на антиген 7А6 антителами АР02.7 (Coulter Immunotech, Marseille, France).
Клетки фиксировали 3.7% раствора параформальдегида фирмы (MG Scientific, Fort Collins, СО).
Для активации CD8' Т клеток использовали: анти-СОЗ и анти CD28 антителами фирмы (Pharmingen, San Diego, СА); РМА (форболмиристат) фирмы (Sigma, ) иономицин фирмы (Sigma). Внутриклеточную продукцию цитокинов блокировали с помощью Golgi Plug (Pharmingen, San Diego, CA). Размножение клеток оценивали окрашиванием на антиген Ki-67 антителами (Pharmingen, San Diego, СА). Подсчет клеток осуществляли методом TRUCOUNT (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
Вирусную продукцию измеряли методом ELISA (Coulter Immunotech, Miami, FL).