Роль аминокислот в регуляции активности и множественных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда

• Автор: Гаверова, Юлия Геннадьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 с. : ил.

Глава 1. Влияние аминокислот на активность ферментов
(обзор литературы)
1.1. Влияние аминокислот на ферменты микроорганизмов
1.2. Влияние аминокислот на ферменты растений
1.3. Влияние аминокислот на ферменты животных
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Материал
2.2. Введение аминокислот
2.3. Приготовление экстрактов растворимых белков
2.4. Определение активности а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и ма-латдегидрогеназы
2.5 Выявление множественных форм дегидрогеназ
26. Определение активности множественных форм дегидрогеназ
2.7. Исследование воздействия аминокислот на дегидрогеназы in vitro
2.8 Исследование влияния аминокислот на уровне
транскрипции и трансляции
2.9. Методы выделения и очистки отдельных форм
НАД*-зависимой малатдегидрогеназы
2.9.1. Осаждение растворимых белков сульфатом аммония
2.9.2. Гельфильтрация
2.9.3. Концентрирование образцов
2.9.4. Препаративный электрофорез
2.10 Определение молекулярных масс форм малатдегидрогеназы жирового тела методом гельфильтра-ции
2.11. Определение изоэлектрических точек форм малатдегидрогеназы жирового тела методом изоэлектрофокусирования
2.12. Определение протеолитической активности
2.13. Исследование влияния протеолитических ферментов на образование высокоподвижной формы малатдегидрогеназы
2.14. Статистическая обработка результатов эксперимента
Глава 3. Влияние аминокислот на активность и множест-

венные формы малатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы тутового шелкопряда и вощинной моли
3.1. Влияние аминокислот на активности и множественные формы малатдегидрогеназы, глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегид-рогеназы гусениц вощинной моли
3.2. Влияние аминокислот на активность и множественные формы а-глицерофосфатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда
3.3. Влияние аминокислот на активность и множественные формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда in vivo и in vitro
3.4. Влияние аминокислот на активность и множественные формы малатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда
Глава 4. Изучение механизмов воздействия аминокислот
на малатдегидрогеназу тутового шелкопряда с использованием ингибиторов транскрипции и трансляции
Глава 5. Выделение и свойства форм малатдегидрогеназы, выявленных в жировом теле тутового шел-

копряда после инъекции аминокислот
5.1. Выделение форм малатдегидрогеназы, выявленных
в жировом теле тутового шелкопряда после инъекции глицина и серина
5.2. Определение молекулярных масс исследуемых
форм малатдегидрогеназы
5.3. Определение изоэлектрических точек исследуемых
форм малатдегидрогеназы
5.4 Влияние аминокислот на протеолитическую активность в жировом теле и воздействие протеаз на контрольную форму малатдегидрогеназы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.
Анализ содержащихся в современной литературе сведений о регуляции метаболических процессов у различных организмов показал, что в настоящее время уделяется значительное внимание воздействию на ферменты таких природных биологически активных веществ, как аминокислоты. Аминокислоты способны проникать практически во все структуры живых клеток и осуществлять регуляцию активности ферментов на уровне транскрипции, трансляции, посттрансляционной модификации и метаболизма (Eisenstein, 1995; Tipper, Kaufman, 1992; Rishikof et al., 1998; Xu et al., 1998; Kuwahata et al., 1998; Deboer et al., 1998). Они также могут модулировать действие и стимулировать секрецию гомонов (Macdonald et al., 1991; Dongryul et al., 1997; Ushida et al., 1998). Большинство работ по влиянию аминокислот на ферменты выполнено в системе in vitro и посвящено, в основном, аллостерической регуляции их активности. Наиболее изучены в этом плане ферменты аминокислотного и белкового обмена, причем преимущественно у растений (Тюльпанова, Еременко, 1976; Евстигнеева и др., 1985; Расулов, 1990; Lee et al., 1998). Проводятся работы по исследованию воздействия аминокислот in vivo на разнообразные обменные процессы у животных и человека (Кричевская и др., 1983; Massillon et al., 1996; Bergamini et al., 1995). Имеются данные, хотя и весьма немногочисленные, о воздействии аминокислот на активность дегидрогеназ у разных объектов (Rosenbrough, 1996; Malik, Ahluwalia, 1994). С помощью аминокислот пытаются лечить некоторые нарушения обмена веществ у человека и животных (Dekoning et al., 1998; Lemosquet et al., 1997).
Исследования по влиянию аминокислот на ферменты насекомых крайне немногочисленны. Изучению подвергались в основном ферменты аминокислотного и белкового обмена, и соответствующие исследования проводились преимущественно in vitro (Горленко, Грошева, 1984; Агаджанян, Арутюнян, 1974). В то же время известно, что концентрация свободных аминокислот в организме насекомых достигает значительно бо-

2. Воздействие аминокислот характеризуется видовой и тканевой специфичностью, что вероятно связано с особенностями генетического контроля синтеза ферментов и их множественных форм. В то же время, дифференцированное воздействие аминокислот на изоформы ферментов остается очень слабо изученным, особенно у животных, и насекомых в том числе.
3. Аминокислоты способны воздействовать не только на ферменты белкового обмена, но и на разнообразные энзимы других ветвей обмена (углеводного и липидного в частности). В то же время конкретные механизмы участия аминокислот в регуляции активности ферментов, непосредственно не относящихся к обмену аминокислот и белков, изучены еще в минимальной степени. В связи с этим особый интерес представляет изучение воздействия аминокислот на ключевые ферменты метаболизма, и в частности те из них, которые участвуют во взаимосвязи обмена веществ в организме.
4. Насекомые принадлежат к числу наименее изученных видов с точки зрения воздействия аминокислот на их ферменты и, одновременно, учитывая их эволюционное положение, огромное разнообразие и широкие возможности регуляторных механизмов, представляют собой несомненно перспективные объекты такого рода исследований.
Учитывая выше изложенное, мы поставили перед собой задачу исследовать воздействие аминокислот на ряд ферментов насекомых, избрав для этой цели три дегидрогеназы: НАД*-зависимую малатдегид-рогеназу (КФ 1.1.1.37), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (КФ 1.1.1.49) и а-глицерофосфатдегидрогеназу (КФ 1.1.1.8). Выбор этих ферментов базировался на следующих обстоятельствах.
1. Все эти ферменты обладают, в соответствии с литературными данными, высокой активностью в тканях и органах разных видов насекомых (Farkas, Knopp, 1997; Sonoli, Hooli., 1992; Борзаковская и др., 1991; Scaraffia et al., 1997), и по крайней мере для двух из них (глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы) на различных объектах показана возможность воздействия аминокислот (Коничева и др., 1984; Rosenbrough, 1996; Malik, Armstrong, 1997).
2. Эти ферменты обладают множественными формами, для которых отработаны надежные способы разделения и количественной оценки их