Получение иммуносорбента для удаления β 2-микроглобулина из крови человека

• Автор: Шабунина, Ирина Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 94 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список использованных в работе сокращений.
ВВЕДЕНИЕ. Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Структура и метаболизм р2-микроголобулина.
1.2. Роль р2-М в развитии гемодиализ ассоциированного амилоидоза.
1.3. Лечение гемодиализ ассоциированного амилоидоза Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Получение моноспецифических поликлональных антител.
2.1.1. Получение моноспецифической сыворотки К р2-М.
2.1.2.Очистка антител
2.1.3. Метод двойной радиальной имму но диффузии.
2.2. Синтез аффинных сорбентов,
2.2.1. Активация матриц.
2.2.2. Иммобилизация антител на полисахаридную матрицу.
2.2.3. Иммобилизация р2-М.
2.3. Определение сорбционной емкости иммуносорбентов.
2.3.1. Метод колоночной хроматографии.
2.3.2. «Бетч» метод.
2.4. Электрофоретические методы.
2.4.1. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
2.4.2. Иммуноблотинг.
2.5. Синтез конъюгатов поликлональных антител с пероксидазой.
2.6. Определение концентрации р2-М методом простой радиальной иммунодиффузии.
2.7. Иммуноферментный метод определения концентрации антител к Р2-М в сыворотке крови барана.
2.8. Иммуноферментный метод определения концентрации р2-М.

2.9. Определение белка.
2.10. Концентрирование белков.
2.11. Определение параметров коагуляционного гемостаза. 3
2.12. Определение фибринолитической активности крови.
2.13. Исследование реологических свойств крови. 3
2.14. Статистическая обработка результатов.
Глава 3. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Получение моноспецифических поликлональных антител к р2-М 39 человека и их характеристика.
3.2. Метод определения концентрации р2-М в плазме крови для 45 лабораторного использования.
3.3. Синтез и характеристика иммуносорбента на основе 49 поликлональных антител и Сефарозы СЬ-4В.
3.4. Характеристика иммуногемосорбента анти-(32-М Сефарозы 6МВ.
3.5. Изучение изменения параметров крови при проведении 65 модельных экспериментов на анти-р2-М Сефарозе 6МВ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список использованных в работе сокращений и обозначений:
(32-М - р2-микроглобулин
ГАА - гемодиализ ассоциированный амилоидоз
ХПН - хроническая почечная недостаточность
СГФ - скорость гломерулярной фильтрации
3-DG - 3-деоксиглюкозон
AGE - advanced glycation end-product
ALE - advanced lipoxidation end product
RAGE - receptor for advanced glycation end product
HPLAC - проточная жидкостная аффинная хроматография высокого
давления
ПАФ - полный адъювант Фрейнда
нПАФ - неполный адъювант Фрейнда
ФБ - фосфатный буфер pH 7,
ПкАт - поликлональные антитела
ПААГ - полиакриламидный гель
ИФА - иммуноферментный анализ
IgG - иммуноглобулины класса G
РИД - радиальная иммунодиффузия по Манчини
АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время
СОЭ - скорость оседания эритроцитов
MCV - средний объем гематокрита
МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроците
МСНС - средняя концентрация гемоглобина в эритроците
ИАЭ - индекс агрегации эритроцитов
ИДЭ - индекс деформируемости эритроцитов.

использовали 2-хлор-нафтол.
2.5.Синтез конъюгатов поликлональных антител с пероксидазой.
Для решения ряда экспериментальных задач были получены антитела барана против [32-М, конъюгированные с пероксидазой. Конъюгирование проводили по методике Farr (Farr G.A., 1981), 10 мг пероксидазы (тип VIII «Sigma», США) растворяли в дистиллированной воде, окисляли 4% раствором перйодата натрия (20 минут при комнатной температуре). Окисленную пероксидазу наносили на колонку с Sephadex G-25 («Pharmacia», Швеция) объемом 10 мл. Собирали окрашенные фракции, pH которых доводили до 9.5 при помощи 0,2 М раствора гидроксида натрия, и добавляли 10 мг белка антител. Конъюгирование проводили в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем добавляли раствор боргидрида натрия до конечной концентрации 0.4 мг/мл. Полученный конъюгат диализовали против фосфатного буфера, затем концентрировали обратным диализом в 70% растворе глицерина в воде и хранили при -20°С.
2.6. Определение концентрации р2-М методом простой радиальной иммунодиффузии.
Для определения |32-М в плазме крови человека, а также в растворах, содержащих Рг-М, использовали метод простой радиальной иммунодиффузии (Mancini G., et al., 1970), который был нами модифицирован для лабораторного использования.
Для приготовления 1% геля использовали низкотемпературную агарозу («Sigma», USA), которая полимеризуется при температуре, не превышающей 45°С и 10 мМ фосфатный буфер pH 6,8. Применение такой низкотемпературной агарозы позволило избежать тепловой денатурации антител в процессе приготовления пластин геля для РИД. Раствор