Разработка способов регулирования TNF-зависимого апоптоза

• Автор: Мошникова, Анна Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 149 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Исследование спектра свойств фактора некроза опухолей
1.1. Фактор некроза опухолей продуцируется широким рядом клеток
1.2. Структура фактора некроза опухолей
1.3. Плейотропные активности фактора некроза опухолей
1.4. Возможности клинического использования TNF
2. Молекулярные механизмы клеточных сигналов, активируемых при связывании TNF с рецепторами
2.1. Анализ биологических активностей, опосредованных рецепторами TNF
2.2. Рецепторы TNF относятся к семейству рецепторов TNF
2.3. Начальные этапы сигнальных путей, опосредованных TNF-RI
2.4. Начальные этапы сигнальных путей, опосредованных TNF-RII
2.5. Разнообразие молекулярных механизмов, опосредующих передачу внутриклеточных сигналов

3. Способы регуляции клеточного ответа путем модификации белок-белковых
взаимодействий
3.1. Использование антител к "рецепторам смерти" при индукции клеточной гибели
3.2. Получение трансфектантов с заданными свойствами
3.3. Использование кросс-линкеров для индукции и(или) модификации клеточной гибели
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Использование цитотоксических анти-Fas антител для регуляции клеточной
гибели, индуцированной TNF
2. Регуляция экспрессии белков семейства Вс1-2 как способ модификации
TNF-зависимой клегочной гибели
3. Исследование возможностей регулирования TNF-зависимой гибели на этапе
активации эндонуклеаз
4. Использование химических кросс-линкеров для индукции апоптоза.
4.1. Гомобифункциональный кросс-линкер DMS как индуктор апоптоза трансформированных клеточных культур.
4.2. Гомобифункциональный кросс-линкер BSOCOP как индуктор апоптоза трансформированных клеточных культур.
4.3. Гетеробифункциональный кросс-линкер EDC как индуктор апоптоза трансформированных клеточных культур.
5. Исследование возможностей модификации TNF-зависимой клеточной гибели химическими кросс-линкерами.
6. Исследование противоопухолевой активности кросс-линкеров в экспериментах in vivo.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Прснраммируемая клеточная гибель (апоптоз) ифает важную роль в формировании и функционировании многоклеточных организмов. Она обнаруживается на самых ранних стадиях эмбриогенеза при формировании органов, замене одних тканей на другие, резорбции временных органов и т.д. Во взрослых организмах поддержание гомеостаза в нормальных тканях происходит за счет баланса между клеточной пролиферацией и клеточной смертью. Дефекты генов, которые контролируют апоптоз, могут приводить к возникновению рака и аутоиммунным заболеваниям, если апоптоз супрессируется, или нейродегинеративным болезням и иммунодефициту, если апоптоз стимулируется (Korsmeyer, 1995). Апоптоз могут вызывать как внутриклеточные сигналы, например, повреждения ДНК или активация онкогенов, так и внешние факторы: UV- или у-лучи, температурный шок, окислительный стресс, химиотерапевтические средства, вирусные инфекции, глюкокортикоиды, недостаток специфических ростовых факторов, растворимые или трансмембранные формы цитокинов, таких как TNF или Fas/Apo-1 лиганд, и ряд других факторов (Хансон, 1998).
Среди различных моделей клеточной гибели апоптоз, индуцируемый TNF. исследуется наиболее интенсивно в связи с его большой биологической значимостью (Baker and Reddy, 1998; Wallach et al., 1998). Цитотоксические эффекты TNF представляют особый интерес по нескольким причинам. Во-первых, в отличие от классических картин апоптоза, таких как гибель под действием глюкокортикоидов и у-облучения, где добавление ингибиторов синтеза РНК или белка препятствует развитию цитотоксических процессов (Wyllie et al., 1980; Sellins and Cohen, 1987), TNF-индуцированная гибель не зависит от синтеза белка и РНК de novo, и более того, в ряде случаев требует подавления синтетических процессов (Beutler and Cerami, 1988). Эти данные предполагают существование в клетках суицидного аппарата, совместимого с нормальным клеточным метаболизмом и активируемого при цитотоксическом воздействии. Во-вторых, TNF может вызывать гибель и по типу некроза и по типу апоптоза в зависимости от типа клеток (Laster et al., 1988; Schulze-Osthoff et al.. 1992). И, наконец, благодаря интенсивным исследованиям последних лет, механизмы передачи сигналов, опосредованных фактором некроза опухолей, изучены полнее, чем для других физиологических цитотоксических лигандов (Liu et al., 1996; Baker and Reddy, 1998; Wallach et al, 1998).

Белок I-TFAF/TANK, связывающийся с TRAF2, стимулирует при определенных условиях активацию NF-кВ (Rothe et al., 1996; Cheng and Baltimore, 1996). I-TRAF, по-видимому, способен ингибировать связывание TRAF-2 с TNF-RII. и таким образом регулировать активацию NF-кВ, опосредованную через TRAF-2. Данное предположение согласуется с данными, показывающими, что гиперэкспрессия I-TRAF/TANK ингибирует активацию NF-кВ при TNF-зависимом апоптозе. С другой стороны, экспрессия уменьшенного с С-конца I-TRAF/TANK (остатки 1-168) способствует активации NF-кВ (Cheng and Baltimore, 1996).
Белки TRAF2A, TRAF1, TRIP, A20 и филамин ингибируют TRAI'2-зависимую активацию NF-кВ. TRAF2A, являясь продуктом альтернативного сплайсинга TRAF2, может связываться с цитоплазматическим доменом TNF-RII и другими белками TRAF семейства. Последовательность TRAF2A включает 7 дополнительных аминокислот внутри RING finger домена TRAF2 (Brink and Lodish, 1998). В отличие от TRAF2, TRAF2A не способен стимулировать активацию NF-кВ, и более того, повышенная экспрессия TRAF2A в клетках ингибирует Т11АР2-зависимую активацию NF-кВ.
Другой NF-кВ-ингибирующий белок TRAF1 обнаружен в гетерокомплексе TRAF2-TRAF1 (Rothe et al., 1994). Для TRAF1 характерно отсутствие RlNG-домена и, соответственно, способности непосредственно взаимодействовать с TNF-RII. Показано, что TNF индуцирует синтез TRAF1, а повышенная экспрессия TRAF1 полностью блокирует TNF-зависимую активацию NF-кВ (Carpentier and Beyaert, 1999). Следующий природный регулятор, способный ассоциировать с TNF-RII-сигнальным комплексом за счет своего взаимодействия с TRAF2 - это белок TRIP, который ингибирует TRAF2-опосредованную активацию NF-кВ и, по-видимому, вовлечен в передачу сигналов, вызывающих активацию и (или) пролиферацию клеток (Lee and Choi, 1997). Белок А20, находясь в ассоциации с комплексом TRAF2-TRAF1, также ингибирует TRAF2-опосредованную активацию NF-кВ (Song et al., 1996). Кроме того, был идентифицирован белок ABIN, с которым способен связываться А20. Показано, что этот белок мимикрирует ингибирование активации NF-кВ, наблюдаемое при гиперэкспрессии А20 (Heyninck et ah, 1999). К такому же эффекту приводит повышенная экспрессия белка филамина, способного физически ассоциировать с TRAF2 (Leonardi et al., 2000).
Еще один способ негативной регуляции активности NF-кВ заключается в фосфорилировании TRAF-связывающего домена TNF-RII киназой pSOTRAK, подобной