Регуляция экспрессии генов плацентарного трансформирующего фактора роста-β и β-рецептора тромбоцитарного фактора роста кальцитриолом в клетках LNCaP рака предстательной железы

• Автор: Назарова, Надежда Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 136 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 ВВЕДЕНИЕ
1.1 Актуальность проблемы
1.2 Цели и задачи исследования
1.3 Основные положения, выносимые на защиту
1.4 Научная новизна
1.5 Научное и практическое значение работы
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Открытие и структура витамина Д
2.2 Метаболизм и транспорт витамина Д
2.3 Молекулярные механизмы действия кальцитриола
2.3.1 Регуляция экспрессии генов
2.3.2 “Быстрое” негеномное действие кальцитриола
2.4 Биологические функции витамина Д
2.5 Предстательная железа как орган-мишень кальцитриола
2.5.1 Эпидемиологические исследования
2.5.2 Метаболизм витамина Д и экспрессия гена НЖ и предстательной железе
2.5.3 Действие кальцитриола на клетки рака предстательной железы
2.5.3.1 Подавление пролиферации
2.5.3.2 Индукция дифференцировки
2.5.3.3 Индукция апоптоза
2.5.3.4 Подавление ангиогенеза и инвазии клеток
2.5.4 Взаимодействие между сигнальными системами кальцитриола и андрогенов
2.6 Суперсемсйство факторов роста ТСГ-р и рак предстательной железы
2.7 Суперсемейство факторов роста РПОР/УКСР и рак предстательной железы
2.8 Заключение
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Препараты, приготовление растворов
3.2 Методы клеточной биологии
3.2.1 Культивирование клеток
3.2.2 Обработка клеток гормонами и факторами роста
3.2.3 Анализ скорости роста клеток
3.2.3.1 Метод окрашивания клеток кристаллическим фиолетовым (Киепц, 1989)
3.2.3.2 Оценка количества жизнеспособных клеток методом исключения трипанового синего
(Т еппапб 1964)
3.2.4 Анализ адгезивных свойств клеток (МопЫмяье, 1991)
3.3 Методы анализа нуклеиновых кислот
3.3.1 Выделение РНК
3.3.2 Электрофорез РНК (Мавек, 2005)
3.3.3 Скрининг генов на микрочипах кДНК
3.3.3.1 Получение меченой кДНК
3.3.3.2 Гибридизация кДНК с мпкрочипами
3.3.3.3 Обработка данных
3.3.4 Обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени54
3.3.5 Анализ стабильности РНК (Ьес1егс, 2002)

3.4 Методы белковой химии
3.4.1 Выделение белков из культуры клеток
3.4.2 Аналитический электрофорез белков в присутствии ЗЭЭ (ЬаештИ, 1970)
3.5 Высокоэффективная жидкостная хроматография
4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Скрининг генов, регулируемых кальцитрнолом в клетках рака предстательной
железы человека линии ЫЧСаР
4.2 Индукция экспрессии гена плацентарного трансформирующего фактора роста-Р
(РТСР-Р) кальцитрнолом
4.2.1 Кальцитриол индуцирует экспрессию гена РТОб-р в клетках ЬМСаР
4.2.2 Действие пифитрина-а на содержание мРНК РТОР-р в клетках ЬМСаР, инкубированных с
кальцитрнолом
4.2.3 Действие РТйР-р на клетки ЬМСаР. Его регуляция кальцитрнолом
4.2.3.1 Рекомбинантный РТСР-р подавляет рост клеток ЬМСаР
4.2.3.2 Рекомбинантный РТОР-р не влияет на адгезию клеток ЬМСаР к белкам базальной мембраны
4.2.3.3 Рекомбинантный РТОР-Р индуцирует фосфорилирование киназ, регулируемых внеклеточными сигналами (ЕЯКЛ и ЕЯК2)
4.2.3.4 Антитела к РТОР-р частично восстанавливают рост клеток ЬМСаР, инкубированных с кальцитрнолом
4.2.4 Взаимодействие между кальцитрнолом и 5а-дигидротестостероном (ОНТ) в регуляции
экспрессии гена РТОР-Р
4.3 Подавление экспрессии гена (1-рецептора тромбоцитарного фактора роста
(РОСРИр) под действием кальцитриола
4.3.1 Экспрессия генов рецепторов РЭОР в клетках эпителия и стромы предстательной железы
человека
4.3.2 Кальцитрнол подавляет экспрессию гена РйОРКр в клетках предстательной железы линий ЬМСаР и Р29БМ
4.3.3 РОвЬ-ВВ усиливает рост клеток ЬМСаР в присутствии ЕОР
5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬ ТА ТОВ
5.1 Скрининг генов, регулируемых кальцитрнолом в клетках ЫЧСаР
5.2 Индукция экспрессии гена РТСР-Р кальцитрнолом
5.3 Взаимодействие между кальцитрнолом н ШГГ в регуляции экспрессии гена РТСР-р
5.4 Подавление экспрессии гена РОСтр кальцитрнолом
6 ВЫВОДЫ
7 БЛАГОДАРНОСТИ
8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

...91 „

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АЛ рецептор андрогенов
ВМР морфогенетический белок кости
ВРН гиперплазия предстательной железы
СаМК Са2+-кальмодулин-зависимая киназа
СВР белок, связывающийся с фактором СЛЕВ, узнающим сАМР-зависимый элемент
сбк циклин-зависимая киназа
Ст пороговый цикл амплификации
БВБ ДНК-связывающий домен
БВР белок, связывающий витамин Д
БСС-ЕВБ сыворотка крупного рогатого скота, обработанная декстрином
БЕРС диэтилеппирокарбонат
БНТ 5а-дигидротестостерон
ОПІР комплекс белков, взаимодействующих с УБЯ
ЕСЕ эпидермальный фактор роста
ЕЛК киназа, регулируемая внеклеточными сигналами
РАБ синтаза жирных кислот
ЕВБ сыворотка крупного рогатого скота
НАТ ацетилтрансфераза пистонов
РЮАС деацетилаза гистонов
ЮВР внутриклеточный белок, связывающий витамин Д
ЮЕ инсулинонодобный фактор роста
ЮЕВР белок, связывающийся с ЮР
ЬВБ лиганд-связывающий домен
МАРККК киназа киназы митоген-активируемой протеинкиназы
ІЧСоЛ корепрессор ядерных рецепторов
Ш ядерный рецептор
ИБАІБ нестероидный противовоспалительный препарат
пУБЛЕ репрессирующий УБЛЕ
РБОЕ тромбоцитарный (фактор роста
РБвЕЛ рецептор тромбоцитарного фактора роста
РІЗК фосфатидилинозитол-3-киназа
РКА протеинкиназа А
РКС протеннкиназа С
РБА специфический антиген предстательной железы
РТН паратиреоидный гормон
РТОР-Р плацентарный трансформирующий фактор роста-(3
ЛАЛ рецептор транс-ретиноевой кислоты
ЛРЬРО кислый рибосомный фосфорилированный белок РО
ЛХЛ рецептор цис-ретиноевой кислоты
БЛС коактиватор стероидных рецепторов
ТвР-Р траисфюрмирующий фактор роста-ф
тря рецептор ТОЕ-ф
УБЯ рецептор витамина Д
УБЯЕ витамин Д-чувствительная последовательность ДНК
УЕвЕ сосудисто-эндотелиальный фактор роста
а.к. аминокислотный остаток
БСА бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
кДНК комплементарная ДНК

предстательной железы. По-видимому, в этом отношении PDGF-ß разделяет основные черты факторов роста суперсемейства TGF-ß, которые могут как подавлять, так и стимулировать развитие опухоли в зависимости от физиологических свойств среды и клеточного окружения.
Факторы роста TGF-ß действуют в составе гомодимеров. Большинство факторов супсрсемейства секретируется в виде предшественников, содержащих большой просегмент и зрелый С-концевой пептид, связанные дисульфидными мостиками. После димеризации просегмент остается связанным с _ димером и поддерживает его в неактивном состоянии заякоренным на экстраклеточном матриксе через скрытый TGF-ß связывающий белок (LTBP) (Annes, 2003). Активация происходит путем протеолитического отщепления просегменга, приводящего к высвобождению димера. Доступность факторов TGF-ß регулируется многими как секре тируемыми, так и заякоренными на матриксе белками, которые связывают ростовые факторы, и тем самым, выводят их из среды связывания с рецепторами (Annes, 2003).
Факторы суперсемейства TGF-ß связываются с двумя структурно родственными трансмембранными рецепторными комплексами семейства сериновых/треониновых протеинкиназ (Feng и Derynck, 2005). Характерной особенностью этих рецепторов является складка типа “tree - finger toxin” в лиганд-связывающем экстраклеточном домене (Greenwald, 1999), наличие единственного трансмембранного домена и внутриклеточного протеинкиназного домена. Рецепторы типа I отличаются от рецепторов типа II наличием богатого глицином и серином примембранного активирующего домена (GS домен). Несмотря на структурное сходство два типа рецепторов играют различную роль в проведении сигнала. В отсутствие лиганда рецепторы обоих типов находятся в составе гомодимеров. После связывания лиганда с обоими типами рецепторов одновременно, конститутивно активный киназный домен рецептора типа II фосфорилирует рецептор типа 1 по множеству сайтов в составе GS домена (Wrana, 1994). Активированный таким образом рецептор типа I запускает каскад сигнальных реакций в цитоплазме (Massague, 2005).