Несопряженная NADH : Хинон оксидоредуктаза Azotobacter vinelandii и ее роль в осуществлении дыхательной защиты

• Автор: Берцова, Юлия Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Краткое описание фиксации молекулярного азота
и структуры нитрогеназного комплекса
2. Влияние кислорода на активность нитрогеназного комплекса
3. Регуляция экспрессии нитрогеназного комплекса
4. Защита нитрогеназного комплекса от повреждающего действия кислорода у различных азотфиксирующих микроорганизмов
5. Положение в систематике и некоторые общие характеристики Azotobacter vinelandii
6. Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у A.vinelandii
7. Дыхательная цепь A.vinelandii
7.1 Терминальные оксидазы A.vinelandii
7.1.1. Цитохромоксидаза о-типа
7.1.2. Хинолоксидаза Ы-типа
7.2. Роль хинолоксидазы bd-типа A.vinelandii в реализации механизма дыхательной защиты
7.3. Кислород-зависимая регуляция хинолоксидазы
М-типа у A.vinelandii
7.4. Азот-зависимая регуляция хинолоксидазы bd-типа
7.5. Предполагаемая роль первичных дегидрогеназ дыхательной
цепи A.vinelandii в осуществлении дыхательной защиты
7.6. Бактериальные NADHixhhoh оксидоредуказы
7.6.1. NADH:xhhoh оксидоредуктаза I (NDHI)
7.6.1. NADH:xhhoh оксидоредуктаза II (NDH II)
7.6.3. Окисление NADH дыхательной цепью A.vinelandii

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Культивирование бактерий
1.1 Штаммы микроорганизмов, использованные в работе
1.2. Выращивание клеток A. vinelandii и E. coli
1.3. Хранение и проверка используемых штаммов
2. Определение концентрации белка
3. Получение клеточного лизата и суббактериальных частиц
из клеток A. vinelandii и E.coli
4. Определение цитохромного состава суббактериальных
частиц, выделенных из клеток A.vinelandii
5. Определение соотношения Н+/е‘для ферментов
дыхательной цепи A.vinelandii
6. Регистрация дыхания клеток или суббактериальных
частиц A. vinelandii
7. Измерение генерации АрН на суббактериальных частицах A.vinelandii с флуоресцентным индикатором
акридиновым оранжевым
8. Измерение генерации А'Р на суббактериальных частицах A.vinelandii с оксанолом VI
9. Регистрация окисления NADH и dNADH клеточным лизатом
или суббактериальными частицами A.vinelandii и E.coli
10. Определение Кт для различных субстратов для NDH I и NDH II
11. Определение величины KLa (ммоль 02 х л'1 х ч'1), характеризующей поток кислорода
12. Получение ndh' штамма A.vinelandii методом
направленного мутагенеза
12.1. Амплификация фрагмента гена ndh
12.2. Клонирование ПЦР продукта в вектор pGEM-T

12.3.Получение конструкции рСЕМ/псШ::Тс
12.4. Получение компетентных клеток АМпеЬпсШ
12.5. Трансформация компетентных клеток А. inelandii
12.6. Сегрегация мутации в гене пёк у А.уте1апйи ОИ165
12.7. Получение конструкций для определения
нуклеотидной последовательности целого гена пАк
12.7.1. “Высвобождение плазмиды”
12.7.2. ПЦР с “обратных” праймеров
12.8. Стандартные генетические методы
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Исследование протонтранслоцирующей активности хинолоксидазы
Ьс1- типа А.У1пе/апс1И. 5
2. Исследование альтеративной терминальной ветви дыхательной
цепи А.уте1апс1и
3. Исследование окисления КАОН дыхательной цепью А.уте1апАи
4. Исследование протонтранслоцирующей активности
N А ЮН :убихинон оксидоредуктаз АМпе1апАи
5. Исследование экспрессии активности N0111 и КОН II у А.уте1апсШ
при различных условиях выращивания
6. Получение несодержащего КОН II штамма А. уте1апс1н
6.1. Клонирование фрагмента гена псИг из АМпе1апсШ:
6.2. Внесение кассеты устойчивости к тетрациклину
в клонированный фрагмент
6.3. Внесение мутации в хромосомальную ДНК
АМпе1апсШ и^АЗб
7. Определение ферментного состава КАОН дегидрогеназного участка дыхательной цепи мутантного штамма ОШ65 АМпектсШ
8. Роль несопряженной КАОН.убихинон оксидоредуктазы в чувствительности к кислороду азотофиксирующей

12.5.Трансформация компетентных клеток A.vinelandii.
Трансформацию компетентных клеток A.vinelandii проводили согласно методике описанной в (Glick et al., 1985) с некоторыми модификациями. К компетентным клеткам добавляли плазмиду pGEM/ndh::Tc (20 мкг в 50 мкл) и инкубировали их в течение 50 мин при 30°С. По окончании инкубации клетки разводили в 800 мкл свежей среды BSN-Fe, содержащей 16 мМ MgSO^, и инкубировали в течение 2,5 часов при интенсивном перемешивании при 30°С. Затем клетки концентрировали в 200 мкл среды и высевали на чашку с агаризованной средой BSN-Fe. Трансформированные клетки выращивали в течение 24 часов и смывали с чашки. Полученный смыв рассевали на серию чашек с агаризованной средой BSN, содержащей тетрациклин (10 мкг/мл), Рост отдельных колоний на селективной среде проводили в течение 3 суток после чего полученные клоны анализировали на их способность к росту на среде содержащей, ампициллин (50 мкг/мл). Анализ чувстительности клонов к ампицилину и тетрациклину позволял определить способ интеграции плазмидной ДНК в хромосому A.vinelandii, так как для клонов, где интеграция плазмидной ДНК произошла путем одиночного гомологичного кроссинговера, характерен фенотип AmpRTcR, в то время как при двойном гомологичном кроссинговере проявляется фенотип AmpsTcR. Так был получен штамм A.vinelandii DN165, в котором в последовательность гена ndh в результате двойного кроссинговера была встроена кассета устойчивости к тетрациклину. Один из клонов (N24), в котором мутация являлась следствием одиночного кроссинговера был в дальнейшем использован для клонирования З’-концевой часть гена ndh с использованием метода “высвобождения плазмиды”.
12.6.Сегрегация мутации в гене ndh у A.vinelandii DN165.
Для получения штама с мутацией, представленной во всех копиях геномной ДНК, клон A.vinelandii DN165, полученный на селективной среде с 10 мкг/мл тетрациклина был рассеян до отдельных колоний на среде с повышенным содержанием антибиотика (до 30 мкг/мл). Отдельный клон