Целлобиозодегидрогеназа почвенного аскомицета ИНБИ 2-26(-)

• Автор: Карапетян, Карен Навасардович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Почвенные грибы и их роль в трансформации растительных

остатков.

1.1.1. Разложение древесины грибами

1.1.2. Грибы, вызывающие мягкую умеренную гниль.

1.1.3. Базидиомицеты возбудители бурой грили

1.2. Ферменты грибов, трансформирующие полисахаридную и ароматическую часть растительного субстрата
1.2.1. Внеклеточные ферменты грибов, участвующие в превращении углеводной части липюцеллюлозныъх субстратов
1.2.2. Ферментные системы грибов, трансформирующис ароматическую часть растительного субстрата лакказы.
1.3. Целлобиозодегидрогеназы древоразрушающих и почвенных грибов мягкая, бурая гниль, базидомицеты.
1.3.1. Характеристика целлобиозодегидрогеназ из различных грибов
1.3.2. Структура ЦДГ
1.3.3. Каталитический механизм
1.3.4. Связывание с целлюлозой
1.3.5. Возможные функции ЦДГ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы.
2.2. Культивирование грибов.
2.3. Разложение соломы в лабораторном реакторе для контролируемой твердофазной ферментации
2.4. Аналитические методы.
2.4.1. Выделение и очистка фермента.
2.4.2. Определение ферментативной активности.
2.4.3. Совместное определение лакказы и ЦДГ с помощью дихлорфенолиндофенола.
2.4.4. Стационарная кинетика
2.4.5. Концентрация белков
2.4.6. Электрофорез.
2.4.7. Адсорбция ЦДГ на целлюлозе.
2.4.8. Изоэлектрофокусирование
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разложение компонентов лигноцеллюлозного субстрата овсяная солома сообществом мицелиальных грибов ИНБИ 2, а также его отдельными компонентами продуцентами лакказы и ЦДГ
3.1.1. Разложение соломы штаммомпродуцентом лакказы ИНБИ 2 и смешанной культурой ИНБИ 2 и продуцента целлюлаз Тпс1юс1егта гееэе
3.1.2. Разложение овсяной соломы штаммами 2, 2 и смешанной культурой в жидкой среде
3.2. Выделение и характеристика ЦДГ из нового продуцента СИаеЮтшт вр. ИНБИ 2
3.3. Стационарная кинетика восстановления одно и двухэлсктронных акцепторов ЦДГ
3.4. Адсорбция ЦДГ на целлюлозе. Катализ сопряженного процесса
гидролиза целлюлозывосстановления ДФИ
Выводы.
Список литературы


Полагают, что, специфически адсорбируясь на целлюлозе, ЦДП не только удаляет ингибитор цсллюлаз целлобиозу, но и разрушает кристаллическую структуру полисахарида путем генерации ОНрадикалов, через реакцию Фентона, сопряженную с катализируемым ЦДГ восстановлением Бс3. Такой механизм, в частности, предложен для базидиомицета возбудителя бурой гнили Сотоога рШеапа НеппкББОп е1 а1. Указанные проблемы определили интерес к выделению и характеристике ЦДГ из нового неспорулирующего мицелиального грибапродуцента ЦДГ. Цель настоящей работы заключалась в исследовании роли ЦДГ этого мицелиального грибааскомицета в процессе разложения лигноцеллюлозы, а также изучении ее каталитических свойств. Изучить способность компонентов сообщества мицелиальных грибов ИНБИ 2 продуцента лакказы 2 и продуцента ЦДГ 2, а также смешанной культуры разлагать основные биополимеры натурального лигноцеллюлозного субстрата. Выделить индивидуальную ЦДГ и изучить се физикохимические свойства и субстратную специфичность. Выяснить возможный кинетический механизм действия фермента в реакциях с двух и одноэлектронным акцептором. Изучить способность ЦДГ к адсорбции на целлюлозе и ее функционирование совместно с целлюлазами в процессе гидролиза целлюлозы. Механизм биодеградации липюцеллюлозы активно исследуется в связи с большой теоретической и практической значимостью этой проблемы Фенгель и Вегенер, i . . ii, i, Рабинович и Мельник, Рабинович и др. Болобова и др. Поскольку объектом наших исследований было сообщество почвенных мицелиальных грибов ИНБИ 2, секрстирующих ЦЦГ и лакказу, в этой главе будут изложены в основном данные по внеклеточным ферментам грибов, разрушающих растительные субстраты. Почвенные грибы и их роль в трансформации растительных остатков. Основную часть микроорганизмов, способных разлагать растительные остатки в подзолистых почвах, составляют грибы родов iii, i, i, i . В дерновоподзолистых почвах наряду с грибами родов i, i, i, iii, в разложении целлюлозы участвуют целлюлозные бактерии, обнаруженные в небольших количествах. Видовой состав разлагающих целлюлозу микроорганизмов серых почв представлен грибами родов i, i, , актиномицеты в них малочисленны Рабинович и др. Почвенные грибы характеризуются высокой устойчивостью к кислой реакции среды. Некоторые грибы способны разлагать гумус, способствуя освобождению азота, который, в свою очередь, усваивается растениями. В образовании гумуса существенная роль принадлежит лигнину, содержащему фенольные мономеры, которые образуют лигнопротеиновый комплекс с аминокислотами и пептидами. Клеточные стенки древесных тканей высших растений состоят главным образом из целлюлозы, которая содержит неразветвленные цепи р1,4глюкана, образующие более или менее упорядоченные образования или микрофибриллы Рабинович и др. Эти микрофибриллы внедрены в смесь гемицеллюлоз, которые чаще всего разветвлены и более аморфны, чем целлюлоза, и лигнина, который является беспорядочным и разветвленным полимером кониферилового, пкумарового и синапового спирта. Кроме того, клеточная стенка содержит небольшие количества белка, крахмала, пектина и воска. Сложность и гетерогенность древесины делает ее хотя и богатой энергетически, но трудной мишенью для микробной деградации. Поэтому ферменты, которые включаются в этот процесс, имеют многие необычные и интересные характеристики. Широкий круг мицелиальных грибов, заселяющих древесные субстраты, представлен видами, потребляющими основные составные части древесины целлюлозу, лигнин, гемицеллюлозы и вызывающими ее разложение по типу белой, бурой или мягкой гнили, а также грибами, живущими, за счет экстрактивных веществ и других компонентов, накопленных в запасающих клетках древесины, и заметно ее не разрушающими. Большая часть деградации древесины в почве выполняется аэробными грибами белой и мягкой тили. Оба класса грибов вызывают деградацию целлюлозы и гемицеллюлозы в растворимые углеводы с помощью системы внеклеточных полисахаридгидролаз, функционирующих в синергизме Болобова и др.