Связывание апоВ-содержащих липопротеинов с иммобилизованным ЛНП-рецептором

• Автор: Якушкин, Владимир Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 155 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общая характеристика липопротеинов крови млекопитающих
2.2. Рецепторы липопротеинов
2.3. Взаимодействие липопротеинов с ЛНП-рецептором
2.4. Способы анализа связывания лигандов с рецепторами
3. Методы исследований
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Получение антител против ЛНП-реце?птора
4.1.1. Получение белкового препарата, предназначенного для иммунизации
4.1.2. Иммунизация, отбор гибридомных клеток и очистка антител
4.1.3. Характеристика полученных антител
4.2. Выбор способа иммобилизации ЛНП-рецептора
4.2.1. Неспецифичная сорбция афинно-очищенного рецептора
4.2.2. Иммобилизация афинно-очищенного ЛНП-рецептора с использованием антител У
4.2.3. Иммобилизация ЛНП-рецептора из Рец:ДЕАЕ-препаратов
4.2.4. Сравнение различных способов иммобилизации ЛНП-рецептора
4.3. Выбор условий проведения анализа
4.3.1. Покрытие полистерольной поверхности V5-антителами
4.3.2. Инкубация с РецгДЕАЕ-препаратом
4.3.3. Инкубация с альбумином
4.3.4. Инкубация с липопротеинами
4.3.5. Инкубация с анти-апоВ-антителами
4.3.6. Детекция пероксидазной активности

4.3.7. Описание разработанной процедуры анализа связывания
липропротеинов с иммобилизованным ЛНП-рецептором
4.4. Связывание изолированных липопротеинов с иммобилизованным ЛНП-рецептором
4.4.1. Связывание изолированных ЛНП с иммобилизованным ЛНП-рецептором
4.4.2. Связывание изолированных ЛОНП с иммобилизованным ЛНП-рецептором
4.5. Связывание апоВ-содержащих липопротеинов из нефракционированных сывороток крови с иммобилизованным ЛНП-рецептором
4.5.1. Предварительное рассмотрение
4.5.2. Применение сывороток в качестве эталонных образцов для стандартизации измерений
4.5.2.1. Способ измерения относительной эффективности связывания лигандов
с рецепторами (RBA-параметр)
4.5.2.2. Оценка стабильности разработанного способа анализа связывания липоропротеинов с иммобилизованным ЛНП-рецептором
4.5.3. Вклад различных липопротеинов в связывание апоВ-содержащих липопротеинов из нефракционированных сывороток с
иммобилизованным ЛНП-рецептором
4.5.4. Применение анализа связывания апоВ-содержащих липопротеинов из нефракционированных сывороток с иммобилизованным ЛНП-рецептором
для выявления дефектных форм аполипопротеинов ВиЕ
5. Заключение
6. Выводы
7. Список литературы

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ЛНП - липопротеины низкой плотности ЛОНП - липопротеины очень низкой плотности апоВ - аполипопротеин В апоЕ — аполипопротеин Е
Рец:Аф-ЛНП - ЛНП-рецептор, афинно очищенный на сефарозе, коваленто связанной с ЛНП
Рец:Аф-У5 - ЛНП-рецептор, афинно очищенный на сефарозе, коваленто связанной с антителом V
Рец:ДЕАЕ-Окт - ЛНП-рецептор на стадии очистки после ДЕАЕ-хроматографии в октилглюкозиде
Рец:ДЕАЕ-Трит - ЛНП-рецептор на стадии очистки после ДЕАЕ-хроматографии в Тритоне Х-
Ка - равновесная константа диссоциации
(параметр, характеризующий сродство лигандов к рецептору)
RBA - relative bindig ability
(параметр, характеризующий сродство лигандов к рецептору)
FDB - familial defective ароВ binding (наследственное заболевание, при котором апоВ обладает пониженной способностью к связыванию с ЛНП-рецептором
SDS-ПААГ-электрофорез - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS
анти-IgG-nX - меченные пероксидазой хрена антитела против IgG мыши анти-апоВ-ПХ - меченные пероксидазой хрена антитела против апоВ человека

Известно еще несколько рецепторных белков, также как ацЛНП-рецептор включаемых в группу скэвенджер-рецепторов и способных связываться с модифицированными липопротеинами. В число подобных рецепторов входят, прежде всего, несколько следующих белков, способных связываться с окисленными ЛНП-частицами: (а) рецептор FcyRlI-B2 (рецептор из мышиных макрофагов, распознающий Fc-участки иммуноглобулинов IgG) [215]; (б) белок CD36 с молекулярной массой 8В кДа, присутствующий на поверхности макрофагов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток человека [216, 217]; (в) белок макросиалин с молекулярной массой 95 кДа из макрофагов мыши [218-221]; (г) экспрессируемый в Купферовских клетках печени крысы рецептор окисленных ЛНП, имеющий молекулярную массу 95 кДа и являющийся, по видимому, идентичным макросиалину [222-224]; (д) лектин-подобный рецептор окисленных ЛБП (LOX-1), присутствующий на поверхности макрофагов и эпителиальных клеток быка и человека [225].
Кроме того, обнаружен еще один скэвенджер-рецептор, обозначаемый как SR-B1 {scavenger receptor class В type I) и присутствующий в клетках печени и стероид-синтезирующих тканей грызунов [226]. Характерной особенностью данного рецептора является его способность связываться не только с модифицированными, но и с нормальными ЛНП и ЛВП-частицами, и в настоящее время считается, что SR-B1-рецептор может являться физиологическим рецептором для нормальных ЛВП [191-193].
2.2.6 LRP-белок
В 1988 году в результате скрининга геномной библиотеки, содержащей кДНК из клеток печени человека, был обнаружен ген, кодирующий белок, обладающий значительным структурным сходством с ЛНП-рецептором и получивший название LRP {low density lipoprotein receptor-related ptotein) [227]. LRP человека оказался близким по структуре к аналогичному белку, присутствующему в организме мыши, что позволило использовать одни и те же олигонуклеотидные зонды для детекции мРНК, кодирующей LRR, в клетках человека и в клетках мыши. В частности, таким образом было определено содержание мРНК, кодирующей LRP, в различных тканях организма мыши и было обнаружено, что наибольшая активность экспрессии LRP наблюдается в клетках печени, легких и головного мозга. Использование антител, полученных против синтетического пептида, соответствующего фрагменту LRP-белка, позволило в той же работе [227] подтвердить присутствие LRP в клетках печени человека и обнаружить, что местом локализации LRP в клетках является наружная клеточная мембрана. Кроме