Структурно-функциональные исследования IgG1 человека : Выявление и локализация свободных остатков цистеина

• Автор: Волынская, Алла Марковна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ „

1. ВЗАИМОСВЯЗЬ СТРУКТУРЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ G-КЛАССА И
ИХ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ (обзор литературы)
1.1. Структура иммуноглобулинов G-класса
1.1.1. Fab фрагмент
1.1.2. Fc фрагмент
1.1.3. Шарнирный регион
1.1.4. Пространственная структура
1.1.5. Подклассы IgG человека
1.2. Эффекторные функции иммуноглобулинов
1.2.1. Активация системы комплемента
1.2.2. Индукция опсонизации
1.2.3. Лигандсвязывающие участки Fc фрагмента
1.3. Механизмы функционирования иммуноглобулинов
1.3.1. Модель изменения конформации
1.3.2. Аллостерическая модель
1.4. Свободные остатки цистеина и их возможное участие в функционировании
антител
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Выделение IgGl
2.2.2. Анализ белковых и пептидных фракций
2.2.2.1. Определение концентрации белка
2.2.22. Гель-электрофорез
2.2.2.3. Электроблоттинг
2.2.2.4. Определение класса и подкласса иммуноглобулинов
2.2.2.5. Определение агглютинирующей способности

2.2.2.6. Аминокислотный анализ
2.2.2.7. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности
2.2.2.8. Определение N-концевого аминокислотного остатка
2.2.3. Методы определения SH-групп и дисульфидных связей
2.2.3.1. Предварительная подготовка белка
2.2.3.2. Меркаптидирование
2.2.3.3. Алкилирование
2.2.3.4. Тиол-дисульфидный обмен
2.2.4. Получение Fab и Fc фрагментов иммуноглобулина G1
2.2.5. Определение С-концевой аминокислотной последовательности алкилированного Fab фрагмента
2.2.6. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата
Fab фрагмента IgGl
2.2.7. Выделение флуоресцентномеченых пептидов из гидролизата IgGl
2.2.8. Определение агглютинирующей способности модифицированного IgGl
2.2.9. Определение местоположения легкодоступного остатка цистеина
2.2.10. Методы статистической обработки данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение гомогенного препарата IgGl человека
3.2. Определение числа свободных остатков цистеина в IgGl человека
3.2.1. Легкодоступные остатки цистеина
3.2.2. Маскированные остатки цистеина
3.3. Локализация четырех свободных остатков цистеина в IgGl
3.3.1. Поиск свободных остатков цистеина в Fab и Fc фрагментах
3.3.2. Анализ С-концевой последовательности Fab фрагмента
3.3.3. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов Fab фрагмента IgGl
3.3.4. Выделение и анализ флуоресцентных цистеинсодержащих пептидов IgGl

3.4. Определение значимости легкодоступного остатка цистеина для функционирования
3.5. Локализация легкодоступного остатка цистеина в
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ПРИЛОЖЕНИЕ Акты внедрения

2.2.2.3. Электроблоттинг
Часть полиакриламидного геля, содержащего белковые зоны, отрезали и осуществляли их перенос на иммобилон-Р в 0.025 М натрий-бикарбонатном буфере (pH 9.0), содержащем 0.1% 805 и 20% метанола (при силе тока 400 мА). Время переноса составляло 3 часа. Мембрану промывали последовательно метанолом, водой МПН-О, 30% метанолом и высушивали на воздухе. Белковые полосы на мембране детектировали в результате окрашивания раствором амидо черного в 45% растворе метилового спирта. Полосы, содержащие белок, вырезали и подвергали анализу первичной структуры.
2.2.2.4. Определение класса и подкласса иммуноглобулинов
Принадлежность выделенных иммуноглобулинов к И-классу, подклассу 1§С 1 определяли методом двойной радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони [176]. Иммунодиффузию проводили в 1.25% агаре, приготовленном на 0.15 М растворе хлорида натрия. Лунки (иЗмм) с антисыворотками располагали по окружности, лунку с исследуемым препаратом иммуноглобулинов - в центре. После внесения исследуемого раствора белка и моноспецифических сывороток чашку Петри выдерживали во влажной камере при температуре +4°С в течение 48 часов. Результаты иммунодиффузии учитывали непосредственно на влажном препарате после окрашивания линий преципитации 0.01% кумасси 0-250 в водном растворе, содержащем 10% уксусной кислоты и 10% метанола.
2.2.2.5. Определение агглютинирующей способности
Способность 1^01 к поливалентному связыванию определяли при помощи реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) [177]. Тестирование сыворотки крови донора и выделенного из нее препарата 1§С1 проводили в 96-ти луночных "и" - образных полистирольных планшетах. Серию двукратных разведений сыворотки (30 мкл) и ^С11 (0.245 мг в объеме 30 мкл)