Получение трансгенных мышей, несущих митохондриальную ДНК человека, передаваемую потомству

• Автор: Соколова, Василина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 102 с. : ил.

1. Обзор литературы
1.1. Строение митохондрий
1.2. Функции митохондрий
1.2.1. Продуцирование энергии митохондриями
1.2.2. Митохондрии в оогенезе и раннем эмбриогенезе
1.2.3. Участие митохондрий в апоптозе
1.3. Митохондриальный геном
1.3.1. Строение митохондриальной ДНК
1.3.2. Репликация мтДНК
1.3.3. Транскрипция мтДНК
1.3.4. Регуляция биогенеза митохондрий
1.4. Биосинтез белков в митохондриях
1.5. Особенности генетики митохондрий
1.6. Митохондриальные заболевания
1.7. Современные представления об изучении и терапии митохондриальных болезней
2. Методы и материалы
2.1. Выделение фракции митохондрий человека из культуры
клеток Нер02 и анализ функциональной активности
2.2. Подготовка животных
2.2.1. Гормональная стимуляция самок и суперовуляция
2.2.2. Техника стерилизации самцов
2.2.3. Подготовка псевдобеременных самок
2.3. Манипуляции с эмбрионами
2.3.1. Получение оплодотворенных яйцеклеток лабораторных животных (мышей) для цитоплазматической микроинъекции
2.3.2. Цитоплазматическая микроинъекция митохондриальной фракции человека в оплодотворенные яйцеклетки лабораторных мышей
2.3.3. Культивирование доимплантационных зародышей in vitro
2.3.4. Разделение на бластомеры культивируемых in vitro
зародышей 2-х и 4-х клеточной стадии развития
2.3.5. Трансплантация зигот самкам-реципиентам
2.4. Выделение ДНК
2.4.1. Выделение ДНК из зародышей 7ого-10ого дня внутриутробного развития
2.4.2. Выделение ДНК из зародышей 1 loro и 13ого дня внутриутробного развития и новорожденных мышей
2.4.3. Выделение ДНК для контроля
2.5. ПЦР-анализ
2.5.1. Разработка видоспецифичных праймеров
к мтДНК человека и мыши
2.5.2. Анализ ДНК зародышей доимплантационных сроков развития
2.5.3. Анализ ДНК постимплантационных зародышей
и новорожденных мышей
2.6. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле (ПААГ)
3. Результаты
4. Обсуждение результатов
5. Выводы
Список литературы

В середине девятнадцатого века митохондрии впервые привлекли внимание исследователей механизмов клеточной жизнедеятельности. Многочисленные, легко выделяемые, являющиеся богатым источником ферментов, необходимых для выполнения разнообразных функций, эти органеллы были в центре внимания при изучении основных принципов клеточной энергетики. По прошествии многих лет, когда исследования функций ядерных генов стали более доступными, интерес молекулярных биологов к митохондриям стал спадать.
Однако, публикации последних двадцати лет говорят о том, что митохондрии вновь находятся в центре внимания исследователей, поскольку доказана их значимость для таких областей науки о жизни, как эволюционная биология, исследование механизма клеточной смерти, молекулярная медицина и даже судебная экспертиза (Kiberstis, 1999).
Одним из наиболее важных достижений было признание того, что митохондрии играют центральную роль в регуляции программируемой клеточной смерти или апоптоза. Как показывают многочисленные исследования, митохондрии способны вызывать клеточную гибель несколькими способами: нарушением транспорта электронов через митохондриальные мембраны; высвобождением/активацией белков, которые участвуют в апоптозе, изменением клеточного редокс-потенциала. По отдельности или вместе все эти механизмы помогут объяснить, как митохондриальные дефекты способствуют старению, развитию дегенеративных заболеваний человека и малигнизации клеток (Kroemer et al., 1998, Tsujimoto and Shimizu, 2.000).
Изучение митохондрий играет также существенную роль в эволюционной биологии. Недавно проведенный сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей примитивного митохондриального и эубактериального геномов внес существенные дополнения в известную популярную теорию эндосимбионтного происхождения митохондрий (Gray et al, 1999). Существует и новое направление в использовании митохондриальной ДНК (мтДНК) как критерия для определения родства и

вызывающих в 10 раз более частое, чем в ядерной ДНК, возникновение мутаций мтДНК как в яйцеклетках, так и на ранних стадиях развития организма. Без прояснения этих вопросов развитие исследований в области молекулярной генетики митохондриальных болезней неизбежно замедлится.
Понимание механизмов, лежащих в основе митохондриальных болезней человека, являются также необходимой предпосылкой для разработки подходов их лечения. Несмотря на многолетние попытки, предпринимавшиеся в клинической практике, до сих пор нет эффективных методов лечения больных с митохондриальными патологиями. В печати появлялись сообщения о благоприятном влиянии на симптоматику или на дефекты ферментов таких средств как кофермент Q10, витамин С или никотинамид (Luft, 1994; Matthews et al., 1998; Bakker et al., 1994; Majamaa et al., 1996), но они касались отдельных больных и не давали положительных результатов при массовом применении. В основу метаболической терапии положена попытка стимуляции продукции митохондриальной АТФ. Положительный терапевтический эффект наблюдался при использовании высоких доз коэнзима Q10, менадиона, сукцината, аскорбата, рибофлавина, тиамина, витамина Е, дихлорацетата, но оценка эффективности терапии представляет большие трудности из-за выраженной генетической гетерогенности и клинического полиморфизма митохондриальных болезней (Sobreira et al., 1998). Другим достаточно эффективным подходом коррекции функциональной активности дыхательной цепи является трансплантация здоровых миобластов в мышцы пациентов с митохондриальными миопатиями (Luft, 1994).
Однако оба эти метода терапии митохондриальных болезней не являются универсальными и не обладают желаемой долей эффективности. В настоящее время невозможно предсказать, какой именно больной будет положительно реагировать на избранный метод лечения. Для заболеваний, связанных с мутациями мтДНК, ведутся также исследования по разработке генной терапии, но они находятся еще в начальной стадии. Молекула ДНК, связанная с коротким митохондриальным лидерным пептидом, может быть