Программируемая клеточная смерть дрожжей Saccharomyces cerevisiae, вызванная половым феромоном

• Автор: Кнорре, Дмитрий Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 157 с.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Феномен программируемой клеточной смерти
Характерные признаки апоптоза
Функции апоптоза у многоклеточных
Компоненты каскада самоубийства
Роль митохондрий в апоптозе многоклеточных
Терминология типов клеточной смерти
Апоптотические домены и механизмы апоптоза в разных
систематических группах
Глава 2. Запрограммированная гибель одноклеточных
организмов
Инфузории
Паразитиеские кинетопластиды
Слизевики
Одноклеточные автотрофы
Архемонады
Дрожжи
Глава 3. Молекулярные механизмы программируемой клеточной
смерти дрожжей
Дрожжевая метакаспаза
Протеаза 0т'1
А/Г
Роль митохондрий в программируемой клеточной смерти
дрожжей
Неспецифическая митохондриальная пора дрожжей
Глава 4. Феромонный каскад дрожжей
Биология дрожжей
Клеточный ответ на половой феромон
Гибель клеток Б. се^з!ае, вызванная о-фактором
Глава 5. Кальций в дрожжах

Методы измерения внутриклеточного кальция в S. cerevisiae
Поддержание кальциевого гомеостаза в S. cerevisiae
Амиодарон
Глава 6. Особенности митохондрий пекарских дрожжей
Глава 7. Активные формы кислорода
Особенности образования и детоксикации АФКу дрожжей
S.cerevisiae
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 1. Культивирование дрожжей
Генотипы использованных штаммов дрожжей
Приготовление среды для культивации
Условия культивации
Глава 2. Тесты на выживание дрожжей
Индукция ПКС
Оценка выживаемости по количеству КОЕ
Микроскопические методы
Глава 3. Синхронизация культуры дрожжей
Глава 4. Методы флуоресцентной микроскопии
Окрашивание клеток на АФК
Окрашивание клеток на митохондрии
Окрашивание клеток на Са2+
Окрашивание клеток на ДНЮ
Определение репликативного возраста клеток
Глава 5. Выделение митохондрий из Saccharomyces cerevisiae и
измерение скорости поглощения кислорода
Глава 6. Молекулярно биологические методы
Выделение плазмидной ДНК из E.coli
на колонках Qiagen miniprep kit
Выделение геномной ДНК дрожжей
Расщепление и лигирование ДНК дрожжей

Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях
Трансформация клеток Е.соЧ методом электропорации
Интегративная трансформация дрожжей
Получение мутантных линий с полностью
инактивированным геном
Глава 7. Список использованных реактивов
РЕЗУЛЬТАТЫ
Глава 1. Исследование модели программируемой клеточной смерти дрожжей штамма W303-1B, вызванной избытком
феромона
Глава 2. Исследование ПКС, индуцированный высокой концентрацией
феромона на линии клеток W303-1B стсИ
Глава 3. Влияние ингибиторов и антиоксидантов на ПКС клеток W3031В cmd1
Глава 4. Скрининг генов, участвующих в регуляции программы самоубийства Saccharomyces cerevisiae, вызванного избытком
фермона
Описание скрининга
Результаты скрининга
Анализ мутантов на предмет устойчивости к ПКС, вызванной
избытком феромона
Глава 5 Индукция программируемой клеточной смерти на
промежуточных этапах
Индукция ПКС пекарских дрожжей
перекисью водорода и менадионом
Искусственное повышение концентрации цитоплазматического
кальция
А23187
Амиодарон
Глава 6. Характерные признаки апоптоза, наблюдаемые в клетках обработанных амиодароном

роста клеток, но вызывала гибель порядка 10% клеток. Кроме того, элетропорация обеспечивала проникновение fura-2 только в 10% выживших клеток (lida et al., 1990а), что может служить источником целого ряда артефактов, при условии, если выборка этих клеток не случайна. Еще одна сложность заключается в том, что при связывании кальция зондом fura-2 происходит сдвиг спектра флуоресценции в более коротковолновую область, поэтому, для оценки концентрации кальция используют отношение интенсивности флуоресценции при возбуждении при разных длинах волн, что возможно только на двулучевых микроскопах или флуориметрах (lida et al., 1990а). Недавно для определения цитоплазматического кальция у дрожжей был использован другой кальциевый зонд - fluo-З, который является значительно более простым в употреблении - для его накопления достаточно проинкубировать клетки некоторое время в буфере, содержащим этот зонд (Park et al., 2001 Качественное измерение концентрации кальция можно проводить по его флуоресценции в одной спектральной области 505-510 нм (Park et al., 2001). Однако чувствительность и специфичность этого зонда несколько ниже: KdCa2+= 400 нМ (Minta et al., 1989).
Одновременно с fura-2 был предложен метод определения цитоплазматического кальция дрожжей при помощи системы экспрессии аэквуорина, люминисцентного белка, выделенного из медузы Aequoria victoria и содержащего в качестве флуорохрома коелентеразин. Для этого в клетках экспрессировали белок апоаэквуорин и добавляли в среду роста 50 мкМ коелентеразина, в результате в цитоплазме образовывался зрелый белок аэквуорина, который при взаимодействии с 3 ионами кальция люминесцирует при длине волны 470 нМ. Этот метод позволяет измерять концентрацию внутриклеточного кальция, не повреждая клетки, однако слабая интенсивность флуоресценции не позволяет оценивать изменения концентрации кальция в индивидуальных клетках, а дает только среднюю оценку для клеточной суспензии (Nakajima-Shimada et al., 1991).