Изменение свойств транскетолазы в результате ее взаимодействия с кофакторами и субстратами

• Автор: Есакова, Ольга Александровна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Структура транскстолазы.

1.1 Сравнение структур ано и холотранскстолазы.

1.2 Структура активного центра транскстолазы.

1.2.1 Связывание двухвалентных катионов.

1.2.2 Структура кофермснтсвязывающего участка активного центра транскстолазы.

1.2.3 Протонный канал.

1.2.4 Субстратный канал.

1.2.5 Интермедиат транскетолазной реакции.

2 Механизм транскетолазной реакции

Ч 3 Взаимодействие кофермента с апогранскетолазой.
Ч 4 Участие двухвалентных катионов в связывании тиамнндифосфата
апотранскетолазой
5 Функциональная неэквивалентность активных центров транскстолазы
5.1 Неэквивалентность по связыванию кофермента
5.2 Неидентичность активных центров при химической модификации аминокислотных остатков.
6 Оптические свойства транскстолазы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
1 Материалы.
2 Методы
2.1 Выделение транскстолазы.
2.2 Определение концентрации транскстолазы
2.3 Определение концентрации тиаминдифосфата и его аналогов
2.4 Определение активности транскетолазы.
2.4.1 С использованием глнцеральдегид3фосфатдегидрогеназы
V в качестве вспомогательного фермента
2.4.2 По скорости окисления акарбанионного интермедиата в присутствии феррицианида.
2.5 Определение концентрации ксилулозо5фосфата.
2.6 Определение концентрации рибозо5фосфата
2.7 Определение для тиаминдифосфата.
2.8 Исследование кинетики диссоциации тиаминдифосфата
из активных центров холотранскетолазы.
2.9 Разностные спектры поглощения транскетолазы
2. Спектрофотометрическое титрование.
г 2. Расчет для тиаминдифосфата по результатам
спектрофотометрического титрования
2. кинетика связывания тиаминдифосфата с апотранскетолазой
2. Спектры кругового дихроизма.
2. Триптофановая флуоресценция.
2. Дифференциальная сканирующая калориметрия.
2. Кинетика термоденатурации.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1 Влияние субстратов на реконструкцию холотранскетолазы
из апо и кофермента.
1.1 Разностные спектры поглощения холотранскетолазы
1.2 Влияние субстратадонора на реконструкцию холотранскетолазы в присутствии Са2
1.3 Влияние субстратадонора на реконструкцию холотранскетолазы
в присутствии М2.
1.3.1 Влияние необратимо расщепляемого субстратадонора
на реконструкцию холотранскстолазы в присутствии М2.
1.3.2 Влияние обратимо расщепляемых субстратовдоноров на
реконструкцию холотранскетолазы в присутствии .
1.4 Реконструкция холотранскетолазы в присутствии и субстратаакцептора.
1.5 Взаимодействие апотранскетолазы с неактивным аналогом тиаминдифосфата Шпиридилтиаминднфосфатом.
1.6 Исследование влияния субстратадонора на постаднйное взаимодействие апотранскетолазы с тиаминдифосфатом
1.6.1 Влияние субстратадонора на процесс ассоциации тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в присутствии Са2
1.6.2 Влияние субстратадонора на процесс ассоциации
тиаминдифосфата с активными центрами транскетолазы в
присутствии М2.
1.6.3 Влияние субстратовдоиоров на кинетику диссоциации тиаминдифосфата из активных центров холотранскетолазы
2 Атипичные субстратыдоноры транскетолазы
3 Влияние кофакторов транскетолазы на ее конформацию
и стабильность.
3.1 Влияние двухвалентных катионов на спектры кругового дихроизма транскетолазы в дальнем ультрафиолете
3.2 Влияние кофакторов транскетолазы на се стабильность
3.3 Исследование стабильности холоГК, в зависимости от типа катиона в ее составе Са2 или М2, методом триптофановой флуоресценции в присутствии мочевины
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Методами химической модификации , рентгеноструктурного анализа 2, и направленного мутагенеза идентифицированы аминокислотные остатки, необходимые для связывания ТДФ, субстратов и собственно катализа. Имеется довольно подробная информация об оптических свойствах фермента и их изменениях при связывании с транскетолазой различных лигандов 1, . Показано различное влияние ионов двухвалентных металлов на взаимодействие апотранскетолазы с тиаминдифосфатом. В присутствии ионов кальция фермент характеризуется отрицательной коопсративностыо и высоким сродством к тиаминдифосфату . В . ТДФ , , , . При добавлении к холоТК субстратадонора рис. А происходит образование промежуточного, достаточно стабильного, в отсутствие субстратаакцептора, продукта транскетолазной реакции акарбаниона ДОЭТДФ рис 1Б. К настоящему времени сделан рентгеноструктурнын анализ комплекса ТК с ДОЭТДФ . Согласно этим данным, ДОЭТДФ образует дополнительные, по сравнению с ТДФ, связи с аминокислотными остатками в активном центре фермента и имеет, поэтому, более высокое сродство к апобелку, чем кофермент ,,. ТК была первым ТДФзависимым ферментом, для которого в г. РСА. ТК в широком смысле этого слова, понимая под этим, в частности, изменение конформации функциональная подвижность молекулы фермента в результате его взаимодействия с кофакторами и субстратами. В связи с этим, нашей задачей было исследование влияния кофакторов ТДФ и двухвалентных катионов на конформацию и стабильность ТК, а также влияния субстратов и природы двухвалентных катионов на взаимодействие коферменга с апоТК и образование каталитически активного холофермента. Рис. Траискетолаза была открыта в г. Обнаружена она практически во всех исследованных тканях животного и растительного происхождения, а также у микроорганизмов. Фермент локализуется, преимущественно, в растворимой фракции клетки. В качестве кофакторов выступают ионы двухвалентных металлов Са2 и др. ТДФ. Транскетолаза первый тиаминдифосфатзависимый фермент, для которого был сделан рентгеноструктурный анализ 2, , . Помимо апо и холофермента, к настоящему времени с помощью рентгеноструктурного анализа проанализированы комплексы ТК с различными аналогами ТДФ , , с диоксиэтилтиаминдифосфатом интермедиатом траискетолазной реакции и комплекс холоТК с субстратомакцептором эритрозо4фосфат . Данные рентгеноструктурного анализа охарактеризовали структуру активного центра фермента, а также дали толчок к более глубокому изучению механизма тиаминового катализа. В настоящее время сделан рентгеиоструктурный анализ и других тиаминдифосфатзависнмых ферментов, таких как дрожжевая ПД1С , , ПДК Итотопая тоЬШв , пируватоксидаза , , бензоилформиат декарбоксилаза , человеческая дегидрогеназа акетокнелот . Общая структура этих тиаминдифосфатзависнмых ферментов достаточно сильно различается, однако область связывания двухвалентных катионов и ТДФ имеет значительное сходство. Структура транскстолазы. Объектом наших исследований являлась ТК из vii. Это димер рис. Да. Каждая из субъединиц фермента имеет образную форму и содержит три домена, и все они принадлежат к типу 3, . РРдомен включает 2 аминокислотных остатка. Центральную часть этого домена занимает слой, который сформирован из пяти параллельных структур. Все структуры окружены спиралями 3, . Формирование слоя обеспечивается за счет водородных связей, которые образуются между структурами 3, . Поверхность слоя обращена в межсубъединичнос пространство 3, . Между структурами РРдомсна находится петля аминокислотные остатки с 9 по 4, которая играет важную роль при встраивании кофермента в белок. В результате встраивания ТДФ, петля претерпевает сильные конформационные изменения 3, . Но все же основной функцией аспиралей, окружающих структуру, является формирование междоменных контактов рис. Средний, или Ругдомен, включающий аминокислотные остатки с 3 по 8, также формирует слой, который состоит из шести параллельных структур, окруженных спиралями. Как и у РРдомена, слой Ругдомена обращен в межсубъединичнос пространство 3, .