Молекулярное клонирование и структурная характеристика эндо-1,3-β-D-глюканаз двустворчатых моллюсков

• Автор: Ковальчук, Светлана Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 111 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1, ВЕДЕНИЕ.

2.0БР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. КЛАССИФИКАЦИЯ ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ

2.2. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ.

2.2.1. ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ И ФЕРМЕНТА ТИВНЫЕ СВОЙСТВА ЭНДО1,3рО ГЛЮКАНАЗ СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ.

2.2.2. СТРУКТУРА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ СЕМЕЙСТВА.

2.3. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ.

2.4. ЭНДО1,3Р йГЛЮКАНАЗЫ ДВУСТВОРЧАТЫХ

МОЛЛЮСКОВ.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. УСТАНОВЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
ЭНДО1,ЗрЭГЛЮКАНАЗ ДВУСТВОРЧА ТЫХ МОЛЛЮСКОВ
4.2. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭНДО1, ОГЛЮКАНАЗ
СЕМЕЙСТВА ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ
4.3. КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ ЭНДО1,3рОГЛЮКАНАЗ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ
4.4. ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЭНДО1,3рИ ГЛЮКАНАЗ
ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
днк дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
ЭДТА этилендиаминтелграацетат
о.с. оптическая единица
п.н. пар нуклеотидов
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
а.о. аминокислотный остаток
УСД углевод связывающий домен
р изоэлектрическая точка
мбо среднеквадратичное откл оне ие
ПЦР полимеразная цепная реакция
Дсн додецил сульфат натрия
ПААГ полиакриламидный гель
БСА бычий сывороточный альбумин
ВВЕДЕНИЕ


Таким образом, глубокое изучение физикохимических свойств и механизма действия эндо1,3р0глюканаз двустворчатых моллюсков и отсутствие информации о структуре этих ферментов определили цель данной работы установление и анализ структуры эндо1,3Р0ппокаиаз двустворчатых моллюсков. Установить полные нуклеотидные последовательности кДНК и определить аминокислотные последовательности эндо1,3р0глюкапаз двустворчатых моллюсков на ядсЛашешя, М1гиИорес1еп СЫатуя аШс1ш и С. Матуь гохеа1Ьиз. Провести филогенетический анализ эндо1,3Иппоканаз на основе уже имеющихся в базах данных и полученных нами аминокислотных последовательностей этих ферментов. Построит теорегические модели пространственных структур ЭНДО1,3рглюканаз двустворчатых моллюсков с целью исследования структурнофункциональных особенностей этих ферментов. Исследовать возможность гетерологической экспрессии эндо1,3РПглюканаз двустворчатых моллюсков в клетках ii i. Согласно первой классификации ферментов, разработанной Номенклатурным комитетом Международного биохимического союза в году, Огликозилгидролазы относят к классу гидролаз. В основу этой классификации был положен тип катализируемой реакции, и 2 известных на тот момент ферментов были разделены на шесть классов. Согласно этой классификации эндо1,3РЭглюканазы ЕС 3. Р 1,3глюкозидные связи в 1,3РОглюканах Браунштейн, . Несмотря на достоинства простоту, лаконичность и удобство 1ЦВМВ классификации, она не отражает структурных особенностей ферментов и их эволюционное родство, а также не подходит для ферментов, имеющих широкую специфичность. Так, ряд гидролаз, в том числе и гликозилгидролазы, катализируют не только гидролитическое отщепление определенной группы от своих субстратов, но также реакции переноса этой группы на подходящие акцепторные молекулы, поэтому согласно ШВМВ могут быть классифицированы как трансферазы Браунштейн, . В связи с этим в дополнение к существующей классификации в году была предложена новая классификация гликозилгидролаз, в основу которой был положен принципиально иной критерий сходство первичной структуры этих белков. Предпосылкой для данной классификации послужил революционный скачок в изучении структуры белков благодаря развитию методов молекулярной биологии, генной инженерии и биоинформатики. Согласно этой классификации гликозилгидролазы подразделяются на семейства в соответствии с их структурным сходством. К были установлены структуры 1 гликозилгидролазы, которые были разделены на семейств Неппзэа, . Было показано, что в предложенной классификации семейств оказались моноспецифичными, т. I классификации к разным подподклассам. Так, к семейству гликозилгидролаз были отнесены лихеназы ЕС 3. ЕС 3. Р1,3глюкозидные связи в смешанных 1,3р0глюканах i, . В связи с установлением первичной структуры все новых гликозилгидролаз, предложенная классификация постоянно обновляется и пополняется. В году была предложена новая редакция классификации, охватывающая 2 фермента и состоящая из семейств, к году уже насчитывалось семейств и более 0 гликозилгидролаз i i, . На сегодняшний день классификация охватывает около . Классификация, коррелирующая со структурой и молекулярным механизмом действия ферментов, на данный момент является общепринятым средством для систематизации гликозилгидролаз. Ее главным достоинством является то, что она позволяет с высокой степенью вероятности предсказывать свойства белка и его тип укладки, если установлено, к какому семейству он принадлежит, и известна пространственная структура хотя бы одного из членов этого семейства. Также она позволяет установить потенциальные аминокислотные остатки активного центра на основе выявления подходящих инвариантных аминокислотных остатков vi , i . На сегодняшний день структурная классификация учитывает не только гомологию первичных последовательностей гликозилгидролаз, но и их пространственную структуру. Гликозилгидролазы разных семейств, имеющие схожий тип укладки белковых молекул и одинаковый механизм действия, объединяют в кланы ii, ivi, i . На сегодняшний день гликозилгидролазы сгруппированы в кланов, охватывающих семейств табл.