Поверхностные белки кератиноцитов, участвующие в транспорте нуклеиновых кислот

• Автор: Челобанов, Борис Павлович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 136 с. : ил.

1. Литературный обзор
1.1. Транспорт нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих
ф 1.1.1. Механизмы транспорта нуклеиновых кислот в клетки
1.1.2. Методы изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки
1.1.3. Проблемы, связанные с использованием флуоресценции для изучения транспорта нуклеиновых кислот в клетки
1.1.3.1. Тушение флуоресценции
1.1.3.2. Использование реагентов, предотвращающих выгорание флуорохрома
1.1.3.3. Флуоресценция флуорохрома в составе нуклеиновых кислот
1.1.4. Транспорт флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов в клетки
1.2. Участие белков в транспорте нуклеиновых кислот в клетки

1.2.1. Выявление белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот
1.2.2. Идентификация белков, участвующих в транспорте нуклеиновых кислот
1.2.2.1. Связывание нуклеиновых кислот с глицеральдегид-З’-фосфатдегидрогеназой
1.2.2.2. Связывание нуклеиновых кислот с альбумином
1.2.2.3. Белки, ответственные за транспорт нуклеиновых кислот в сперматозоиды
1.2.2.4. Связывание О-богатых олигонуклеотидов с нуклеолином
1.2.2.5. Эзрин и моезин - компоненты транспортной системы
1.2.2.6. ЫАС1г - мембранный канал, транспортирующий короткие одноцепочечные нуклеиновые кислоты
1.2.2.7. Каналы для транспорта нуклеиновых кислот могут формироваться из факторов транскрипции
1.2.3.8. МЫАВ - мембранный белок, связывающий нуклеиновые кислоты
1.2.2.9. Гепарин-связывающий интегрин Мас
1.2.2.10. Белки, участвующие в реализации иммуностимулирующего действия Срв ДНК
1.2.2.11. Участие скавенджер-рецептора в связывании и транспорте нуклеиновых кислот
1.2.2.12. Заключение

2. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.2. Получение и очистка 32Р - меченых олигонуклеотидов
2.3. Синтез модифицированных олигонуклеотидов
2.4. Клетки и условия их культивирования
2.5. Приготовление слайдов и микроскопия
2.6. Аффинная модификация белков, связывающих нуклеиновые кислоты
2.7. Исследование специфичности аффинной модификации белков
2.8. Исследование локализации белков, связывающих нуклеиновые кислоты
2.9. Влияние целостности клеточной мембраны на модификацию белков, связывающих нуклеиновые кислоты, и внутриклеточный транспорт олигонуклеотидов
2.10. Определение констант диссоциации комплексов олигонуклеотид-белок и определение количества олигонуклеотид-связывающих белков на
клетках
2.11. Получение и характеризация антител против флуоресцеина
2.12. Иммуноферментное окрашивание
2.13. Аффинная хроматография олигонуклеотид-связывающих белков, модифицированных Р1и-1уз-р(М)1б-с^-ио на ультрагсле А2 с иммобилизованными антителами против флуоресцеина
2.14. Синтез пептидов и изготовление конъюгатов этих пептидов с бычьим сывороточным альбумином
2.15. Приготовление человеческого сывороточного альбумина для иммунизации кроликов
2.16. Синтез сорбентов для выделения специфических антител против пептидов и человеческого сывороточного альбумина
2.17. Получение и характеризация антител против К1, К2е и альбумина
3. Результаты и обсуждение
3.1. Аффинная модификация реакционноспособными производными олигонуклеотидов поверхностных белков клеток различного тканевого происхождения
3.2. Влияние условий инкубации аффинных реагентов с клетками на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков
3.3. Влияние ингибиторов активного транспорта на модификацию белков
3.4. Исследование локализации модифицированных белков

3.5. Влияние состояния клеточной мембраны на аффинную модификацию олигонуклеотид-связывающих белков и транспорт олигонуклеотидов в клетки
3.6. Оценка количества олигонуклеотид-связывающих белков на поверхности клетки
3.7. Реакционноспособные олигонуклеотидные реагенты
3.8. Исследование транспорта флуоресцентно-меченых производных олигонуклеотидов в клетки различных линий
3.9. Исследование эффективности модификации поверхностных белков клеток линии А431 различными производными олигонуклеотидов
3.10. Исследование модификации клеток линии А431 реакционноспособными производными флуоресцентно-меченого олигонуклеотида
3.11. Получение антител против флуоресцеина и их взаимодействие с флуоресцеин-содержащими олигонуклеотидами
3.12. Оптимизация условий выделения модифицированных белков, связывающих нуклеиновые кислоты, на сорбенте с антителами против флуоресцеина
3.13. Выделение белков, связывающих нуклеиновые кислоты
3.14. Идентификация олигонуклеотид-связывающих белков
3.15. Изготовление конъюгатов и сорбентов на основе пептидов
3.16. Получение и тестирование антител против альбумина и пептидов р19 и р13
3.17. Исследование клеточной локализации выделенных белков
3.18. Компьютерный анализ структуры альбумина
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

связывают и поглощают плазмидиую ДНК так же, как и макрофаги из контрольных мышей. В обоих типах макрофагов связывание и поглощение плазмидной ДНК значительно ингибировалось немеченой ДНК, poly-I и декстран сульфатом, но не ингибировалось poly-A и ацетилированным липопротеином. Эти данные, по мнению авторов, свидетельствуют о том что связывание и поглощение плазмидной ДНК перитонеальными макрофагами обусловлено механизмом, схожим с механизмом связывания полианионов скавенджер-рецептором, но собственно скавенджер-рецептор не имеет отношения к связыванию и поглощению плазмидной ДНК [188]. Аналогичные данные были получены Butler и соавторами при сравнении мышей, дефицитных по SRA и дикого типа. Было показано, что при внутривенном введении фосфоротиатных олигонуклеотидов картина их накопления и распределения в тканях и клетках идентична для обоих типов мышей, кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды против А-га/ уменьшали уровень м-РНК A-raf в одинаковой степени. Аналогичные данные были получены на перитонеальных макрофагах из тех же линий мышей [189]. Fu-Gang Zhи и соавторы на макрофагах из мышей, дефицитных по SRA и дикого типа, показали, что CpG олигонуклеотиды и бактериальная ДНК стимулировали производство IL-12 в макрофагах обоих типов, а контрольные олигонуклеотиды и ДНК из тимуса теленка не обладали иммуностимулирующим действием. При помощи конфокальной микроскопии было показано, что флуоресцентно- меченые олигонуклеотиды накапливались в цитоплазме и были коллокализованы с декстран сульфатом, который транспортировался в клетки по механизму пиноцитоза. Уровень проникновения олигонуклеотидов и картина распределения были идентичны для макрофагов обоих типов. Эти данные позволили авторам сделать вывод, что хотя SRA и способен связывать ДНК, этот рецептор не важен для поглощения CpG олигонуклеотидов и бактериальной ДНК и проявления их иммуностимулирующих свойств [190].
1.2.2.12. Заключение
Следует отметить, что история со скавенджер-рецептором - это далеко не единственный случай, когда сделанное открытие впоследствии не подтверждается другими работами. В области исследования белков, осуществляющих рецепцию и транспорт нуклеиновых кислот в клетки, это становится правилом. Так, например, Diesbach и соавторы выделили клеточный белок с мол. массой 66 кДа из гепатоцитов линии HepG2 (карцинома печени человека) при помощи фотоаффинной модификации биотинилированным конъюгатом олигонуклеотида с бензофеноном. Было показано, что