Новый тип диссимиляторных нитратредуктаз, не содержащих молибден и молибденовый кофактор

• Автор: Антипов, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1. «Классические» нитратредуктазы
1.1.1. Ассимиляторные нитратредуктазы
1.1.2. Диссимиляторные нитратредуктазы
1.2. Возможность замены молибдена в активном центре на другие металлы
1.3. Общие сведения о ванадии
1.4. Биологическая роль ванадия
1.4.1. Роль ванадия у растений, животных и человека
1.4.2. Концентраторы ванадия
1.4.3. Ванадий в составе ферментов и белков
1.4.4. Ванадий - белковое взаимодействие
1.5. Восстановление микроорганизмами металлов с переменной валентностью и возможное участие нитратредуктаз в этих процессах
1.5.1. Восстановление железа и марганца
1.5.2. Восстановление хрома
1.5.3. Восстановление селена и теллура
1.5.4. Восстановление технеция
1.5.5. Микроорганизмы, обладающие полиредуктазными свойствами
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Объект исследований
2.2. Получение биомассы
2.3. Приготовление клеточного экстракта
2.4. Определение наличия молибдокофактора (Мосо)
2.5. Определение активности МАБН - зависимой нитратредуктазы
2.6. Определение активности метилвиологензависимой нитратредуктазы
2.7. Определение нитратредуктазной активности в ПААГ
2.8. Определение галопероксидазной активности in vitro
2.9. Определение галопероксидазной активности в ПААГ
2.10. Физико-химические методы определения строения веществ
2.11. Определение изоэлектрической точки нитратредуктаз
2.12. Определение молекулярных масс белков
2.13. Определение субъединичного состава ферментов
2.14. Определение ванадия каталитическим методом
2.15. Определение содержания негеминового железа
2.16. Другие методы, использованные в работе
2.17. Реактивы, используемые в работе
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Очистка периплазматической нитратредуктазы
3.2. Очистка мембраносвязанной нитратредуктазы
3.3. Структура ферментов
3.4. Анализ активного центра
3.5. Некоторые свойства нитратредуктаз
3.6. Участие нитратредуктаз в восстановлении ванадата
3.7. Каталитические свойства нитратредуктаз
3.8. Ванадийсвязывающий белок
3.9. Возможные пути поиска альтернативных нитратредуктаз
Выводы
Список литературы

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. Механизм восстановления нитратов с участием нитратредуктаз (HP) изучается более 50 лет. Его универсальность для про- и эукариот, несмотря на разнообразие форм HP, определяется наличием общего молибденового кофактора (Мосо) у всех выделенных до сих пор НР-з. Уникальность Мо в азотном обмене (нитрогеназа и нитратредуктаза) была поставлена под сомнение в начале 80-х годов, когда американским и английским ученым удалось выделить ванадий- и железосодержащие нитрогеназы. Возможность существования «альтернативных», т.е. не содержащих Мо и Мосо НР-з до недавнего времени не обсуждалась, хотя в 70 - 80-х годах была опубликована серия работ H.H. Ивановой, показавших наличие нитратредуктазной активности у растительных пероксидаз. Единственными работами, указывающими на существование ванадийсодержащей ИР, были данные индийских исследователей под руководством профессора Сингха (Хайдарабадский университет), показавших, что у вольфрамустойчивого мутанта Nostoc muscorum, HP активность стимулировалась ванадием, а не молибденом.
В основу данной работы легло предположение о том, что ванадат-восстанавливающие бактерии, выделенные в 80-х годах д.б.н. Ляликовой из источников, обогащенных ванадием (сточные воды завода по переработке ванадиевых руд, кишечник ванадий-концентрирующего морского животного -асцидии), содержат ванадийсодержащую HP вместо обычной молибденсодержащей.
Цель и задачи исследования. Главной целью работы была проверка предположения о наличии ванадийсодержащей нитратредуктазы у ванадат-
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Объект исследований.
В работе использовали ванадатвосстанавливающие бактерии Pseudomonas isachenkovii штамм А-1. Штамм выделен из асцидий, обитающих в бухте Кратерная Курильских островов (Юркова, Ляликова, 1990).
Грамотрицательные, бесспоровые, одиночные прямые палочки размером 2-4 х 0,5-1 мкм. Двигаются с помощью 3-4 жгутиков. Размножаются бинарным делением.
Факультативный анаэроб, хемоорганотроф, факультативный хемолитотроф. В анаэробных условиях использует ванадат или нитрат в качестве акцептора электронов. Донорами электронов в анаэробных условиях с ванадием могут служить следующие органические вещества: глюкоза, мальтоза, рибоза, галактоза, лактоза, арабиноза, лактат, пролин, гистидин, треонин, серии, аспарагин. Кроме того, в анаэробных и в аэробных условиях с ванадием донорами электронов могут служить молекулярный водород и окись углерода. Брожение не происходит. Восстанавливает нитраты до газообразного азота на минеральной среде Шлегеля в атмосфере газовой смеси, состоящей из 75% Н2 и 25% Аг, а также на среде Гильтая. Оксидазололожителен. Каталазоположителен. Гидролиз желатина и крахмала не осуществляет. Гидролизует твин-80. Температурный оптимум 28-30 °С. Оптимальное значение pH среды 7,0-8,0. ГЦ в ДНК 61,8 %.
2.2. Получение биомассы.
Клетки P. isachenkovii выращивали анаэробно в течение 4-8 дней при 30 °С в 10-литровой бутыли на модифицированной среде Постгейта, содержащей