Функциональные свойства мотива В РНК-полимеразы бактериофага Т 7

• Автор: Русакова, Екатерина Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА Т7 РНКП
1.2. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА Т7 РНКП
1.3. ТРАНСКРИПГЦТОНКЫЙ ЦИКЛ Т7 РНК ПОЛИМЕРАЗЫ
1.3.1. Взаимодействие Т7 РНК полимеразы с промотором
1.3.2. Инициация и ранние стадии транскрипции
1.3.3. Элонгационный комплекс и удлинение РНК
1.4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ Т7 РНКП С гМТР И КАТАЛИТИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1.
СРЕДЬ!
2.2. ШТАММЫ Е.СОи, ПЛАЗМИДЫ И БАКТЕРИОФАГ
2.3. МЕТОДИКИ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ. В РАБОТЕ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
3.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ САЙТА ИНИЦИАЦИИ В Т7РНКП С ПОМОЩЬЮ АФФИННОЙ МОДИФИКАЦИИ
3.2. УДЛИНЕНИЕ ДНК-ПРАЙМЕРА С ПОМОЩЬЮ
МУТАНТА TYR639PHE,-SER641 ALA
3.3 САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ В МОТИВЕ В
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
rNTP - рибонуклеозидтрифосфат
dNTP - дезоксирибонукпеозидтрифосфат
п. о. - пара оснований
н.п. - нуклеотидная пара
оцЦНК - однсцепочечная ДНК
Да - дальтон
SDS - додецилсульфат натрия
ЭДТА - этилендиаминотетраацетат натрия
РНКП - РНК-полимераза
Т7 РНКП - РНК-полимераза бактериофага Т7
ПААГ - полиакриламидный гель
м. в. - молекулярный вес
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
MPE-Fe (II) - метидиумпропил ЭДТА Ре (!!)
ДНКаза ! - ДНК нуклеаза !
ТХУ - трихлоруксусная кислота Трис - трисоксиметиламинометан ПЭГ - полизтиленгликсль БСА - бычий сывороточный альбумин ДТТ - дитиотрейтол
MOPS - 3-[Н-морфолино]пропансульфоновая кислота
была сделана в работе [76] с той разницей, что использовались ДНК дуплексы с разной длиной неспаренного участка (20, 5 и 2 пары) и комплиментарный РНК-праймер в некоторых случаях мог образовать шпильку. Авторы обнаружили, что более эффективная элонгация наблюдается при удлинении РНК, содержащих вторичную структуру. Т7 РНКГ! утилизировала неспаренные участки длиной > 20п.о., из чего авторы сделали вывод, что РНКП может использовать в тройном комплексе “пузыри” различных размеров.
Любопытное явление наблюдали авторы [77] - в отсутствие ДНК
матрицы, но в присутствие РНК образцов в транскрипционной смеси, Т7 РНК полимераза синтезирует с них РНК реплику. При избытке фермента количество продукта возрастает экспоненциально, при насыщении РНК-матрицей - линейно. В присутствии ДНК-матрицы этого феномена не наблюдается. Также ничего подобного не происходит в реакциях с РНКП Е.соН, ЭРб. ТЗ РНКП частично активна.
В работах [78,79] в качестве матрицы использовалась ДНК, содержащая в матричной цепи разрыв от 1 до 24 оснований. При отсутствии в матричной цепи от 1 до 9 оснований, транскрипция проходила стой же скоростью, что и на матрице без разрывов. Транскрипт, хотя и соответствовал последовательности матрицы, был короче на длину разрыва (т.е. с делетированного района РНК не синтезировалась). К большому удивлению авторов [79], при разрыве длиной 24 п.о. матрица также утилизировалась РНКП, хотя и медленнее. Авторы предполагают, что при элонгации, когда Т7 РНК полимераза достигает разрыва, нематричная цепь образует петлю и таким образом подводит неповрежденную ДНК в активный центр фермента.