Комплексы полинуклеотидов с белками рибосомы Escherichia coli и их свойства

• Автор: Сарапуу, Таго Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Тарту
• Количество страниц: 147 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК УПОТРЕБЛЯЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ . V.V. . . . .

ВВЕДЕНИЕ . . .

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . . . . . . . . . . . .

Глава I. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МРНК С РИБОСОМОЙ .

1. Связывание мРНК в инициаторном комплексе .

2. Взаимодействие мРНК с рибосомными белками

во время элонгации .

Глава II. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ тРНК С ЗОБ СУБЧАСТИЦЕЙ .

Глава III. МЕХАНИЗМ ОТБОРА аатРНК

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ . .

Глава I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .
1. Использованные реактивы и материалы
2. Выделение суммарного белка субчастиц
и рибосомы Е.со 1г .
3. Выделение рибосомного белка Б1 .
4. Изолирование тРНК Е.соЪг .
5. Фосфорилирование тРНКРе и тРНКа1 .
6. Выделение препарата аминоацилтРНКсинтетазы .
7. Иммобилизация полинуклеотидов на гидразидагарозе .
8. Аффинная хроматография рибосомных белков на колонках с иммобилизованными полинуклеотидами
9. Аффинная хроматография тРНК на колонках с преформированными мРНКибелковыми комплексами
. Видовой анализ тРНК, связанной с
мРНКИбелновыми комплексами
. Равновесное связывание тРНК на преформированном мРНКибелковом комплексе и определение константы диссоциации образующегося комплекса .
. Определение распределения мРНК белкового комплекса в пределе колонки с мРНКагарозой .
Глава II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .
1. Результаты иммобилизации полинуклеотидов.
2. Аффинная хроматография СБ на колонках
с иммобилизованными полинуклеотидами
3. Связывание тРНК на колонках с
преформированными мРНК белковыми комплексами
3.1. Связывание тРНК на мРНКИСБ комплексы
3.2. Анализ тРНК, связанной на колонках
с иммобилизованными полинуклеотидами без рибосомных белков .
3.3. Селекция деацилированной и аминоацилированной тРНК на колонках с преформированным мРНКиСБ комплексом
3.4. Связывание деацилированной тРНК на преформированные мРНКиСБ и мРНКИСБ комплексы.
4. Равновесное связывание тРНК на преформированном мРНКибелковом комплексе и определение константы диссоциации образующегося комплекса.
4.1. Определение константы диссоциации
мРНКиСБтРНК комплекса .
4.2. Определение константы диссоциации
мРНКи3тРНК комплекса .
Глава III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Аффинная хроматография СБ на колонках
с иммобилизованными полинуклеотидами
2. Связывание тРНК на колонках с
преформированными мРНКибелковыми комплексами .
2.1. Связывание тРНК на мРНКиСБ комплексах
2.2. Связывание тРНК на мРНКиСБ
и мРНКиСБ комплексах . .
2.3. Связывание тРНК на МРНКБ4, Б9 и
Б комплексах . .
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ .
ЛИТЕРАТУРА


Изучая взаимодействие матричной РНК с рибосомой надо обратить внимание, вопервых, на те рибосомные компоненты, которые участвуют в связывание мРНК в инициаторном комплексе и, вовторых, на те, которые взаимодействуют с матрицей в процессе элонгации. При образовании комплекса между мРНК и рибосомой во время инициации ключевым является вопрос об опознании инициаторного кодона в цепи молекулы мРНК из числа многих кодонов, находившихся в транслируемом участке матрицы. Участок матричного полинуклеотида, взаимодействующий с рибосомой во время инициации, обхватывает . Данный фрагмент матрицы можно выделить путем нуклеазной обработки . комплекса i, i. , . Определение первичных структур этих фрагментов из разных матричных молекул не привело к решению вопроса о механизме правильного выбора рибосомой инициаторного кодона. Позднее, Шайн и Далгарно обнаружили комплементарное соответствие между 3концевым участком рРНК и 5концевой нетранслируемой нуклеотидной последовательностью мРНК, что позволяло им выдвинуть гипотезу о выборе места инициации в молекуле мРНК посредством взаимодействия матрицы с рРНК i , . Следовательно, определенная роль в опознании инициаторного участка матричного полинуклеотида может лежать и на рибосомных белках. В инициации белкового синтеза существенный вклад в связывание матрицы вносит, очевидно, рибосомная РНК за счет комплементарности 3конца рРНК 5концевым нуклеотидам мРНК. В процессе же элонгации, видимо, основным остается связывание матрицы с помощью рибосомных белков. В изучении этих взаимодействий применяют разные методические подходы химическую модификацию рибосомных белков, аффинную модификацию матричного полинуклеотида, аффинную хроматографию рибосомных белков на иммобилизованном полинуклеотиде в качестве мРНК, УФиндуцированные сшивки между мРНК и рибосомными белками, антитела против белков и др. Устав и Виллеме, . , . В настоящем обзоре обсуждаются некоторые аспекты в узнавании рибосомой инициаторного участка мРНК, в частности роль рРНК и рибосомных белков в этом процессе. Главное внимание обращено на рибосомные белки субчастицы, которые могут взаимодействовать с матрицей в процессе элонгации полипептида. Шайн и Далгарно определили нуклеотидную последовательность 3концевого участка рРНК 53 и отметили, что нуклеотиды 53 являются в комплементарном соответствии с 5нетранслируемыми нуклеотидами мРНК вблизи инициаторного кодона i , . РНК им удалось показать, что во всех анализируемых ими матричных полинуклеотидах имеются соответственные комплементарные участки с Зконцом РНК i , ,. На основе этой комплементарности они выдвинули гипотезу о возможном взаимодействии 5конца мРНК с Зконцом рРНК во время инициации биосинтеза белка i , а. В результате инкубирования рибосом или субчастиц колицином ЕЗ . . рРНК, в составе которого находится и комплементарный участок с 5нетранслируемыми нуклеотидами мРНК. Удаление этого фрагмента с рРНК привело к инактивации рибосом в трансляции . Нарушилось и образование инициаторного комплекса с природными матрицами i, . В лаборатории Боша показали, что при использовании рибосом, лишенных этого фрагмента, нарушалось функционирование фактора инициации I1, что привело к снижению связывания инициаторной тРНК в инициаторном комплексе. Кроме того, замедлялась I3 зависимая диссоциация субчастиц . Им удалось установить, что после образования комплекса инициации, включение каждой последующей аминокислоты в синтезируемый олигопептид вызывает инактивацию приблизительно рибосом, в результате чего синтез белка прекращается после образования пентапептида . Причина подобной инактивации рибосом остается неясной, ибо на основе других данных в тех же условиях трансляция происходит без прерывов, хотя скорость синтеза белка в значительной мере уменьшается V i . i .