Получение и свойства теломеризованных клеток человека

• Автор: Караченцев, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структурам функции теломер

1.1. Теломерная ДНК

1.2. Белки связывающиеся с теломерной ДНК

1.3. ДНКбелковые комплексы высшего порядка

1.4. Теломеры и механизмы контролирующие повреждения в ДНК

1.5. Гетерохроматиновые свойства геломерных регионов

1.6. Особенности наиболее дистальной части теломерной ДНК

2. Фермент теломераза

2.1. Теломераза является РК зависимой ДНК полимеразой

2.2. СтруктураРНК компонента теломеразы
2.3. Каталитическая субъединица теломеразы является обратной транскриптазой
2.4. Механизм работы теломеразы
2.5. Потенциальные дополнительные компоненты теломеразы
2.6. Организация гена каталитической субъединицы теломеразы
3. Функции теломеразы в клетке
3.1. Кон цевая недорепликация хромосом
3.2. Регуляция активности теломеразы в клетке
3.3. Роль репрессии теломеразы в соматических клетках
3.4. Теломеры и старение
3.5. Теломераза и онкогенез
3.6. Нетеломеразное удлинение теломер
4. Увеличение пролиферативного потенциала клеток путем введения гена ЙТЕКТ
4.1. Введение теломеразы в клетки млекопитающих
4.2. Клетки с введенным геном теломеразы не проявляют свойств
характерных для раковых клеток
4.3. Введение теломеразы в различные типы клеток
4.4. Перспективы применения теломеризоватшых клеток МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Культура клеток
1.1. Получение первичных культур фибробластов человека
1.2. Получение первичных культур миобластов человека
1.3. Ведение клеточных культур
1.4. Индукция миогенной дифферешшровки
1.5. Определение пролиферативного потенциала и скорости роста
культуры клеток
1.6. Замораживание клеточных культур
2. Введение гена каталитической субъединицы теломеразы в клетки человека
2.1. Генетические конструкции
2.2. Приготовление ДНК для введения в клетки человека
2.3. Трансфекция ДНК путем электропорации
2.4. Трансфекция ДНК с помощью липофекции
2.5. Селекция клонов и клональный рост
3. Измерение активности теломеразы в клеточных экстрактах
3.1. Получение клеточных экстрактов
3.2. Измерение теломеразной активности
3.3. Определение концентрации белка в экстрактах
3.4. Вычисление теломеразной активности
4. Измерение длины геломер в клетках
4.1. Выделение и очистка геномной ДНК
4.2. Расщепление ДНК и гельэлектрофорез фрагментов
4.3. Перенос ДНК на мембрану по Саузерну
4.4. Гибридизация ДНК
5. Изучение кариотипов
5.1. Приготовление хромосомных препаратов из митотических клеток человека
5.2. Окрашивание хромосом, i
6. Исследование сохранения нормальных механизмов регуляции клеточного цикла
6.1. Радиоавтография и подсчет митотических индексов
6.2. Индукция состояния покоя без сыворотки и в высокой
клеточной плотности
6.3. Индукция клеточного старения путем блокирования функции теломеразы
6.4. Окраска на галакгозидазу
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Введение гена в культивируемые клетки человека
2. Изучение теломеразной активности полученных клонов фибробластов человека
3. Изучение пролиферативного потенциала клеток после введения гена
4. Исследование сохранения нормальных механизмов регуляции клеточного цикла
5. Изучение длины теломер в иммортализованных с помощью теломеразы клетках человека
6. Изучение сгабильности генома теломеризованных фибробластов человека
7. Изучение иммортализующих свойств экспрессии теломеразы
на миобластах человека
8. Изучение теломеразной активности культур миобластов человека после трансфекции гена ЬТЕЯТ
9. Изучение пролиферативною потенциала миобластов человека после введения гена ЫЕЯТ
. Исследование способности теломеризованных миобластов образовывать мышечные волокна
. Изучение клеток, иммортализованных на поздних пассажах плазмидой рИ8
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Индукция теломеразной активности в клетках человека
пугем экспрессии ЬТЕЯТ
2. Длина теломер и пролиферативный потенциал клеток человека после
введения гена каталитического компонента теломеразы
3. Сохранение нормальных механизмов регу ляции пролиферации
в теломеризованных клетках
4. Искусственное старение в культурах теломеризованных фибробластов после блокирование функции теломеразы
5. Стабильность генома теломеризованных фибробластов человека
6. Свойства теломеризованных миобластов человека
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Суть этих ранних наблюдений заключается в том, что разорванная хромосома остается нестабильной до тех пор, пока не обретет новую теломеру либо за счет рекомбинации, либо v. Молекулярные биологи имеют дело со значительно меньшими концевыми районами хромосом, перекрывающими тысячи нуклеотидных пар. Именно с этими теломерами оперирует теломерная теория и именно об этих теломерах пойдет речь в данной работе. На каждом конце линейных эукариотических хромосом находится теломерная последовательность ДНК, у большинства видов, это тандемный повтор короткой последовательности. Тсломераза достраивает многочисленные копии этой ДНК последовательности к концевой части одной из цепей ДНК повторяющегося тракта. В большинстве случаев позвоночные, растения, часть грибов и простейших тсломерные повторы являются совершенными, как например повторы человека или любых других позвоночных. В друг их случаях, однако, как например в случае почкующихся дрожжей, некоторых простейших и слизевых грибов повторы нерегулярны, например, i6 в случае последовательности дрожжей . Егоров, , Табл. Теломерная ДНК у реснитчатых, слизевых грибов дрожжей и человека заканчивается 3 однонитевым неспаренным участком, в который входит несколько повторов ДНК цепи, синтезированной тсломеразой i, . У . ДНК, формируя петлю i vi ii , , . Таблица . Разнообразие теломерных повторов Егоров, . Повтор нукл. Повтор нукл. В делящихся клетках с теломеразой, конец теломерной ДНК находится в состоянии постоянного изменения длины изза добавления и потери нуклеотидов. Такое динамическое состояние было продемонстрировано путем изменения последовательности РНК матрицы в дрожжах v i. Это вызывало соответствующее изменение теломерной последовательности ДНК, добавляемой к теломерному концу i viv. Поскольку эта мутация не отражалась на нормальной работе теломеразы, было возможно проследить динамику теломер в течение многих клеточных делений и наблюдать постепенное замещение терминальной области теломер со средней скоростью п. Субтеломерные последовательности, прилежащие к теломерному повтору часто также являются тандемными повторами общими для всех хромосом, но обычно сильно отличающимися у различных видов. Гомогенность тандемных субтеломерных повторов в пределах видов, очевидно, поддерживается за счет событий неравного кроссииговера. Последовательности, прилегающие к теломерам могут иметь несколько разных форм длинные комплексы тандемных повторов, элементы которые имеют свои собственные точки начала репликации как транспозоны, например . Некоторые эукариотические виды, очевидно, полностью потеряли в процессе эволюции, связанный с теломеразой способ поддержания теломерной ДНК. В этих организмах, теломерная ДНК состоит из последовательностей другого типа, длина которых обеспечивается необычными методами поддержания теломер. В одном таком, хорошо изученном случае, плодовой мушки i теломеры состоят из смешанной мозаики больших транспозонов типа , называемых НсТА и элементы , . Спорадически, один из этих ретротранспозонов добавляется на концевые части хромосом посредством ретротранспозиционных механизмов, что противодействует недорепликации хромосом. Другой, теломсразонсзависимый механизм используется для поддержания теломер у комара i и у лука i сера . Их теломерные области не содержат коротких повторов теломеразного типа вместо этого, их теломеры состоят из больших массивов повторов со сложной носледовагельностью. Эти сложные повторы доходят до самого конца теломеры и имеют такие характеристики, как если бы они поддерживались путем рекомбинации, включающей неравный гомологичный кроссинговер и генную конверсию, т. Выяснено также, что более короткие теломерные последовательности ДНК имеются не только в геломерах, но и диспергировании по другим участкам хромосом различных видов . Полагают, что их появление в нетеломерных областях хромосом обусловлено процессами слияния последних с последующей амплификацией. Существенно, что такие внутрихромосомные повторы ДНК чувствительны к хромосомным разрывам и рекомбинациям, то есть являются горячими точками хромосом, участвующими в хромосомных перестройках.