Активность промотора гена фитохелатинсинтазы риса и псевдофитохелатинового гена в модельных трансгенных растениях табака

• Автор: Постригань, Богдан Нилович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр.

Список условных обозначений.

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. История открытия, биосинтез, структура и функции фитохелатинов.

1.1. Механизмы ответа растений на воздействие тяжелых

металлов

1.1.1. Органические кислоты и аминокислоты

1.1.2. Металл связывающие пептиды.

1.2. Открытие и краткая характеристика

металлотионеинов

1.2.1. Структура металлотионеинов.
1.2.2. Консервативность аминокислотной последовательности металлотионеинов
1.2.3. Кластеры металлов и их структура.
1.3. Структура и биосинтез фитохелатинов
1.4. Физиологические функции фитохелатинов
1.4.1. Участие фитохелатинов в поддержании
гомеостаза
1.4.2. Участие в детоксикации кадмия с образованием комплексов, устойчивость растений к
кадмию
1.5. Индуцируемая экспрессия фитохелатинсинтаз растений на
генном уровне.
1.6 Эксперименты по созданию синтетических
псевдофитохелатиновых генов.
Глава 2. Фиторсмедиация, фитоэкстракция и
фитомайнинг.
ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Реактивы и материалы.
3.1. Объекты исследований, бактериальные штаммы, плазмиды
и фагмидные векторы.
3.2. Реактивы и материалы.
3.3. Составы использованных стандартных
растворов.
Глава 4. Методы исследований
4.1. Выделение и очистка ДНК растений.
4.2. Выделение и очистка РНК растений.
4.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
4.4. Расщепление ДНК рестрикционными
эндонуклеазами
4.5. Ферментативное фосфорилирование
олигонуклеотидов
4.6. Аналитический гельэлектрофорез ДНК в неденатурирующих условиях
4.7. Препаративный гельэлектрофорез ДНК в
неденатурирующих условиях.
4.8. Элюция ДНК из агарозных и полиакриламидных
гелей.
4.9.одготовка компетентных клеток Е.соИ
4 Трансформация компетентных клеток Е.соИ плазмидной
4 Трансформация АгоЬаепит штеаЫепз плазмидными конструкциями.
4 Автоматическое секвенирование ДНК.
4 Синтез кДНК.
4 Полимеразная цепная реакция.
4 Полимеразная цепная реакция в режиме реального
времени.
4 Технология циклирующей пробы
4 Приготовление компетентных клеток .i и
i ii
4 Электропорация компетентных клеток .i и
i i.
4 Агробактериальная трансформация листовых пластинок
табака
4 Выделение тотального белка из растений
4 Флюорометрическое определение активности
репортериого гена .
4 Компьютерный анализ нуклеотидных
последовательностей.
Часть 3. Результаты и обсуждение
Глава 5. Клонирование и экспрессия в трансгенных растениях промоторной гена фитохелатинсинтазы риса
iv
5.1. Оценка экспрессии промоторной области гена
фитохелатинсинтазы риса.
5.2. Клонирование и секвенирование промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса.
5.3. Создание экспрессионной конструкции на основе промоторной области гена фитохелатинсинтазы
5.4. Создание трансгенных растений табака, несущих
промоторную область гена фитохелатинсинтазы риса и ее
экспрессия в них
5.5. Создание делеционного варианта промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса и его экспрессия в трансгенных
растениях табака
Глава 6. Конструирование, клонирование и экспрессия
псевдофитохелатинового гена
6.1. Конструирование и клонирование псевдофитохелатинового
6.2. Создание трансгенных растений, несущих
псевдофитохелатиновый ген и его экспрессия в них.
Заключение.
Выводы.
Список литературы


Большинство этих методов нельзя использовать для очистки территорий, где плодородие почв имеет большое значение . В связи с этим, для очистки и стабилизации загрязненных участков наиболее привлекательным выглядит применение растений, или так называемая фиторемедиация ii. . . ., . При этом стоимость всего комплекса мероприятий по очистке снижается, а какойлибо дополнительный ущерб окружающей среде отсутствует. Фиторемедиация не только способствует удалению из почвы загрязнителей, но и препятствует процессу выщелачивания почв, что приводит к улучшению, или, по крайней мере, к сохранению их структуры, повышению плодородия и сохранению возможности переработки загрязняющих веществ. Данный способ может использоваться для очистки больших территорий, где метод экскавации не приемлем, а также для очистки подземных и сточных вод. Однако на сверхзагрязненных территориях он ограничивается устойчивостью самих растений, применяемых при очистке i . Проблема устойчивости растений к тяжелым металлам имеет как теоретическое, так и практическое значение. Существуют естественные растенияаккумуляторы, которые могут накапливать тяжелые металлы в высоких концентрациях. Однако, чаще всего, они растут медленно и имеют низкую биомассу ii . . Одним из таких свойств является синтез металлсвязывающих пептидов. . За связывание тяжелых металлов в растениях отвечают, помимо прочих механизмов, специализированное семейство генов, кодирующих ферменты глутамилцистеинилдипептидилтранспептидазы фитохелатинсинтазы, при помощи которых происходит нематричный синтез мегаллсвязывающих пептидовфитохелатинов с общей структурой , где п 2 . Vi . При создании растений, пригодных для использования в фиторемедиации, видится перспективным использование регуляторных элементов генов фитохелатинсинтаз, их кодирующей части, а также синтетических псевдофитохелатиновых генов, непосредственно кодирующих фитохелатины с несколько измененной структурой, характеризующейся отсутствием упептидной связи глутамина в силу матричной природы их синтеза. Цели и задачи исследования. Целью данного исследования явилось создание модельных трансгенных растений табака, несущих полноразмерный и делеционный вариант промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса, псевдофитохелатиновый ген и изучение экспрессии данных конструкций в трансгенных растениях. Разработать эффективные методы оценки экспрессии эукариотических генов с помощью технологии циклирующей пробы и ПЦРРВ в присутствии РНКазы Н. I с маркерным геном под контролем клонированного промотора. Путем агробактериальной трансформации создать трансгенные растения табака, несущие промоторную область гена фитохелатиисинтазы риса и определить ее границы. Провести количественную оценку транскрипционной активности промотора фитохелатиисинтазы риса. IА . Создать трансгенные растения табака, содержащие псевдофитохелатиновый ген, и оценить сравнительную устойчивость таких растений к тяжелым металлам. Научная новизна. Разработаны и на примере гена фитохелатиисинтазы риса опробованы два новых подхода к определению и оценке экспрессии безынтронных эукариотических генов, применимых также для анализа экспрессии генов, для которых отсутствует точная информация об интронах. Впервые созданы трансгенные растения табака, несущие генетическую конструкцию на основе промотора фитохелатиисинтазы риса и его делеционного варианта в рамках системы гетерологической экспрессии, в которых промоторная область одного вида растения функционирует в другом. Проведен количественный анализ экспрессии промотора фитохелатиисинтазы и его делеционного варианта в трансгенных растениях табака. Сконструированы олигонуклеотиды, на основе которых создан псевдофитохелатиновый ген, кодирующий фитохелатины матричного синтеза или псевдофитохелатины с последовательностью аминокислот 4. Созданы трансгенные растения, продуцирующие псевдофитохелатины, повышающие устойчивость растений к тяжелым металлам.