Экспрессия синтетических генов антибактериальных пептидов

• Автор: Мартемьянов, Кирилл Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 112 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ
И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Антибактериальные пептиды
1.1. Открытие и разнообразие антибактериальных пептидов
1.2. Классификация антибактериальных пептидов
1.3. Структура антибактериальных пептидов
1.4. Механизм антибактериального действия
1.5. Биосинтез антибактериальных пептидов и организация их генов
2. Клонирование и экспрессия генов . '
й:; Ъ9*' ' *
2.1. Подходы к конструированию синтетических генов
2.2. Прокариотические системы экспрессии генов in vivo
2.3. Прокариотические системы экспрессии генов in vitro
2.4. Клонирование и экспрессия генов антибактериальных пептидов
Резюме
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
III. МАТЕРИАЛЫ
1. Оборудование
2. Реактивы
3. Буферные растворы и среды
4. Бактериальные штаммы
5. Олигонуклеотиды
IV. МЕТОДЫ
1. Синтез и очистка олигонуклеотидов

2. FPLC-хроматография
3. Обессоливание и концентрирование ДНК
4. Фосфорилирование олигонуклеотидов
5. Электрофорез белков и пептидов в полиакриламидном геле
6. Электрофорез нуклеиновых кислот
7. Авторадиография и флюорография
8. Приготовление компетентных клеток
9. Трансформация компетентных клеток
10. Выделение ДНК плазмид
11. Рестрикция ДНК
12. Дефосфорилирование 5’ концов ДНК
13. Отжиг олигонуклеотидов и лигирование
14. Полимеразная цепная реакция
15. Определение нуклеотидной последовательности
16. In vitro транскрипция/трансляция в S-30 экстракте
17. Индукция in vivo экспрессии генов
18. Разрушение клеток и приготовление S-100 экстракта
19. Выделение гибридных белков
20. Расщепление белка по метионину
21. Обнаружение антибактериальной активности
V. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Конструирование генов
1.1. Выбор антибактериальных пептидов
1.2. Экспериментальный подход к синтезу генов
антибактериальных пептидов

2. Синтез и клонирование генов антибактериальных пептидов
2.1. Получение олигодезоксирибонуклеотидов
2.2. Сборка и клонирование генов пептидов
3 Прямая экспрепссия генов антибактериальных пептидов
3.1. Создание генетических конструкций
3.2. In vivo экспрессия генов пептидов в E.coli
3.3. In vitro экспрессия генов антибактериальных пептидов в бесклеточной системе трансляции
4 Экспрессия химерных генов антибактериальных пептидов
4.1. Разработка метода мультимеризации генов
4.2. Генетческие конструкции для экспрессии
химерных генов антибактериальных пептидов
4.3 In vivo экспрессия генов химерных белков
4.4. In vitro экспрессия генов химерных белков
4.4.1. Экспрессия тандемно повторенного гена цекропина
4.4.2. Экспрессия химерного гена GFP-тандемно повторенный цекропин
5. Биосинтез белка в полностью бесклеточной системе
6. Заключение
VI. ВЫВОДЫ
VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
VIII. БЛАГОДАРНОСТИ

Полимеразную цепную реакцию осуществляли на программируемом термостате Progene, Techne (Англия).
В работе использовались также: магнитные мешалки 2ММ, термостаты (Германия), pH-метр рН340 (Россия), магнитные мешалки ММ 2А (Чехия), термостаты MLW (Германия), рН-метр pH 340 (Россия), кондуктометр Radelkis ОКЮ2/1 (Венгрия).
2.Реактивы
В работе использовали следующие препараты и реактивы:
Хроматографические носители: Mono Q, IgG-sepharose 4В, FF (Pharmacia, Швеция). Реактивы для электрофореза: акриламид, метиленбисакриламид, ТЕМЕД, глицин, аммоний надсернокислый (Reanal, Венгрия), агароза (BRL, США), бромистый этидий (Sigma, США)
Для приготовления сред использовались: дрожжевой экстракт, триптон, агар (Difco, США), антибиотики: тетрациклин, ампициллин (Boehringer - Mannheim, Г ермания).
Набор для выделения плазмидной ДНК Wizard Plus Minipreps (Promega, США). Носитель для очистки фрагментов ДНК- Wizard PCR Preps Purification Resin.
Для синтеза олигонуклеотидов: дихлорэтан, 2,4,6 триметилпиридин, уксусный ангидрид, дихлоруксусная кислота, йод кристаллический (Merck, Германия). Тетразол, ß-цианоэтил фосфороамидиты (Pharmacia, Швеция), ацетонитрил( Beckman, США).
Ферменты: Рестриктазы, лигаза, РНКаза A (Pharmacia, Швеция), Т4
полинуклеотидкиназа (Promega, США), щелочная фосфатаза из кишечника теленка, лизоцим (Boehringer - Mannheim, Германия), протеиназа К (Sigma, США), Vent-полимераза (New England Biolabs, США), Taq- полимераза (Н.И. Матвиенко, ИБ РАН). S30 экстракт E.coliпредоставлен П.Н. Симоненко (ИБ РАН).
Плазмиды: pRIT2T, pTZ18R (Pharmacia), pET21d(Novagen, Швеция)