Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12

• Автор: Самсонова, Наталья Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Полиамины в ii i

1.1.1. Эффекты полиаминов i viv и i vi.

1.1.2. Полиамины, представленные в .i.

1.1.3. Влияние полиаминов на адаптацию .i в условиях стрессов.
1.1.4. Биосинтез полиаминов.
1.1.5. Катаболизм полиаминов
1.1.6. Транспортные системы полиаминов
1.2. ответ .i.
1.2.1. Два пути ассимиляция азота в .i
1.2.2. активность. Механизм регуляции ответа.
1.2.3. Роль глутамина и акетоглутарата.
1.2.4. Вклад и в регуляцию ответа.
1.2.5. Особенности а зависимой транскрипции.
1.2.6. Последовательности о5 зависимых промоторов и сайтов связывания I
1.3. зависимые аминотрансферазы
1.3.1. Групиы зависимых аминотрансфераз.
1.3.2. Инвариантные аминокислотные остатки аминотрансфераз
1.3.3. Эволюционные взаимосвязи между зависимыми ферментами
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Бактериальные штаммы
2.1.1 Получение штамма .
2.1.2 Получение штаммов и
2.2 Среды, условия культивирования штаммов и приготовление лизатов клеток.
2.3 Эксперименты с рекомбинантной ДНК.
2.3.1 Г ениоинжснсриые методики
2.3.2 Конструирование рекомбинантных плазмид
2.4 Определение старта транскрипции мРНК гена
2.5 Выделение и очистка белков
2.5.1 Основные методики оценки препаратов белков
2.5.2 Выделение препаратов 1 и 2.
2.5.3 Выделение нативного препарата
2.5.4 Определение олигомерной структуры нативного
2.6 Измерение энзиматических активностей
2.6.1 Методы измерения энзиматических активностей.
2.6.2 Определение основных физических и кинетических параметров препаратов
ПАТаз .
2.7 Программы, использованные для компьютерною анализа
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Идентификация и клонирование гена ii i К, кодирующего
ттутресцинакетоглутарат аминотрансферазу.
3.1.1 Идентификация гена, кодирующего ПАТ азу, в хромосоме .i К.
3.1.2 Амплификация 1,8т.п.н. фрагмента, содержащего структурную
последовательность , в составе мультикопийной плазмиды.
3.2 Изучение структурной организации 1,8т.п.н. фрагмента, содержащего
регуляторную область и кодирующую последовательность гена ПАТазы.
3.2.1 Анализ нуклеотидной последовательности и межцистронного района .
3.2.2 Изучение регуляции экспрессии гена ПАТазы.
3.2.3 Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы.
3.2.4 Анализ продуктов трансляции и 2.
3.3 Характеристика каталитической активности ПАТазы . i
3.3.1 Экспрессия и разработка метода выделения белка .
3.3.2 Определение олигомерной структуры ПАТазы . i
3.3.3 Характеристика субстратной специфичности и основных физических и
кинетических параметров препаратов и
3.4 Влияние аллельного состояния гена на утилизацию путресцина.
3.5 Поиск гомологов белка
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Целью представленной работы являлась идентификация гена . ПАТазу, а также конструирование плазмид, обеспечивающих достаточно высокий уровень продукции этого фермента и определение основных физических и кинетических параметров очищенного препарата ПАТазы. Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма . Разработка лабораторного метода выделение белка из растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантного штамма . Исследование и сравнительная характеристика каталитических активностей и некоторых основных физических и кинетических параметров очищенных препаратов и . Впервые идентифицирован и клонирован ген , кодирующий путресщгн аминотрансферазу в клетках ii i К. Изучена его структурная организация и выявлены регуляторные последовательности, обеспечивающие а зависимую индукцию экспрессии в условиях азотного голодания. Разработана методика получения высокоочищенного препарата каталитически активного белка из биомассы рекомбинантного штамма . Показано, что фермент эффективно катализирует путресцинаКГ аминотрансферазную реакцию, а также может использовать кадаверин и, с меньшей эффективностью, спермидин в качестве доноров аминогрупп. Фермент термостабилен, активен в щелочном диапазоне значений и проявляет максимум активности при 9. С. Интересной особенностью фермента является его способность катализировать глутаматпируват , КФ 2. Ни одна из известных к настоящему времени ношшмин амииотрансфераз не проявляет активности. Субстратная специфичность и зависимость активности совпадаю ПАТазы, выделенной i из мутантного но утилизации путресцина штамма . В6. Сравнение свойств очищенных препаратов и , несущего дополнительную ii6 лидерпую последовательность на конце белка, показало, что данная модификация концевой последовательности влияет на субстратную специфичность и ферментативную активность препарата. Также, элиминация первых аминокислот приводит к практически полной потере активности фермента. Полученные в работе данные могут быть использованы для исследования полиамин амииотрансфераз других микроорганизмов и для дальнейшего изучения путей метаболизма полиаминов в . Глава 1. Полиамины в ii i. Полиамины это класс низкомолекулярных соединений с поликатионной структурой. Полиамины обнаружены во всех видах организмов от бактерий и вирусов до человека. Исследования показали, что полиамины участвуют в огромном количестве разнообразных биологических и биохимических реакций, включая синтез ДИК. РНК и белков 13. Было показано влияние полиаминов на стабильность мембраны и клеточной стенки, а также стабилизирующий эффект полиаминов для микроорганизмов в условиях осмотического и некоторых других видов стресса . В клетках млекопитающих потребность в полиаминах существенно увеличивается в период гормональной стимуляции и клеточной пролиферации ,. Несмотря на то, что впервые цолиамины были обнаружены в тканях животных, большинство биологических эффектов и все биосшггетические пути метаболизма полиаминов были открыты и исследованы в микроорганизмах намного раньше, чем у высших. Исследования метаболических превращений полиаминов в клетках прокариот и эукариот показали, что в различных организмах встречаются не только одинаковые соединения полиаминов чаще всего это путресцин, спермидии, спермин и, существенно реже, кадаверин, но также универсальны и многие этапы их биосинтеза. По этой причине проведение генетических, метаболических и энзиматических экспериментов с целью изучения функций поликатионов в микроорганизмах чрезвычайно важно 4,5. Однако даже у микроорганизмов наблюдаются значительные вариации в составе и концентрациях внутриклеточного пула полиаминов, не оказывающие непосредственного влияния на рост культуры, что существенно усложняет изучение процессов, непосредственно подверженных ВЛИЯНИЮ полиаминов Ш viv у и до сих пор не позволяет получить полную картину, отражающую все многообразие функций этих биологически активных поликатионов 3,.