Структурно-функциональное исследование канала выхода РНК в транскрипционном комплексе E. coli

• Автор: Коржева, Наталия Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .

1.1. Общие сведения о структуре РНКполимеразы . i и стадиях транскрипционного цикла .

1.2. Исторический обзор моделей элонгационного комплекса

1.2.1. Основные характеристики термодинамической

модели

1.2.2. Модель прерывистой элонгации транскрипции .

1.3.0сновные современные направления развития моделей

элонгационного комплекса и появление новых взглядов на механизмы

синтеза РНК .

1.4. Заключение .
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы .
2.2. Плазмиды и олигонуклеотиды .
2.3. Питательные среды
2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий .
2.5. Выделение плазмидной ДНК .
2.6. Неденатурирующий электрофорез ДНК и
выделение ДНК из геля .
2.7. Денатурирующий электрофорез РНК
2.8. Денатурирующий электрофорез белков .
2.9. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2 Выделение РНКполимеразы
2 Определение активности РНКполимеразы
2 Реакция пирофосфоролиза
2Измерение кинетики дезинтеграции ЭК .
2 Получение матрицы со вставкой
некомплементарных нуклеотидов
2 Модификация РНКполимеразы в ЭК 5 концевым фотоактивным и альдегидным реагентами
2 Химический способ расщепления субъединиц
РНК полимеразы
21. Частичное расщепление по остаткам метионина .
22. Частичное расщепление по связи 0
2 Анализ радиоактивных продуктов модификации РНКполимеразы и ДНКматрицы химически
активными производными РНК .
2 Обработка РНКполимеразы РНКазойН
2 Ограниченный трипсинолиз РНКполимеразы
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение минимальной длины РНК,
необходимой для существования стабильного ЭК .
3.1.1. Получение гомогенных ЭК в
системе иммобилизованной РНКполимеразы
3.1.2. Реакция пирофосфоролиза
3.1.3. Сравнение стабильности инициационных и элонгационных комплексов, содержащих РНК одинаковой длины
3.1.4. Измерение кинетик диссоциации
минимальных ЭК .
3.1.5. Изучение свойств минимальных ЭК
3.2. Определение длины РНКДНК гетеродуплекса в ЭК7
3.3. Изучение влияния комплементарности РНК и ДНК в РС на стабильность ЭК .
3.4. Как растущий бконец РНК покидает гетеродуплекс и продвигается
в свой коридор выхода
3.5. ДНК дуплекс позади транскрипционного пузыря оказывает дестабилизирущее воздействие на ЭК с короткими РНК
3.6. Разрушение РНКбелковых взаимодействий в РС
вызывает дезинтеграцию ЭК и освобождение РНК
3.7. Предполагаемый механизм терминации .
3.8. Существование альтернативного пути выхода РНК
без разрушения гетеродуплекса
3.9. Изучение коридора выхода 5конца РНКпродукта в ЭК
3 Свойства РС и канала выхода РНК
3Структурнофункциональная модель элонгационного
комплекса
3 Интерпретация данных, полученных в данной работе, в рамках структуры корфермента РНКполимеразы
ТЬвгтив i
ВЫВОДЫ .
ЛИТЕРАТУРА


ДНК впереди и сзади транскрипционного пузыря, РНКДНК гетеродуплекс, участок растущей цепи однонитевой РНК и однонитевой участок нематричной цепи ДНК. Рис. Схема РНКДНК остова в ЭК. Показано наличие 5 предполагаемых участков, которые могут взаимодействовать с РНКполимеразой. Канал выхода растущего РНКпродукта в рамках этой схемы формируется участками фермента и ДНК в районах РНКДНК гетеродуплекса и однонитевой РНК, контактирующими с транскриптом по ходу траектории его движения в ЭК. Принципиальным является вопрос о том, в какой части этого остова локализуются взаимодействия с белком, обеспечивающие такие противоречивые свойства ЭК, как свободное скольжение вдоль матрицы и одновременно прочное связывание цепей РНК и ДНК. За последние лет было выдвинуто несколько структурнофункциональных моделей ЭК, объясняющих его основные свойства, а именно процессивность, стабильность и терминацию синтеза РНК. Эти модели, поразному рассматривающие роль РНК, ДНК и белка в функционировании ЭК и зачастую противоречащие друг другу, до сих пор не позволили создать единую картину механизма синтеза РНК v i, Н. Р., . iv . А, Б i, . ., i . А, Б. Цель работы и задачи исследования. Целью работы являлось изучение структурных и функциональных взаимодействий растущей цепи РНК и остова ДНК с субъединицами РНКполимеразы, ответственных за главные свойства транскрипционной машины стабильность и процессивность в процессе элонгации. С помощью методов афинной модификации идентифицировать участки субъединиц РНКполимеразы, вовлеченные в образование канала выхода РНК. Определить вклад РНКДНК гетеродуплекса в стабильность ЭК. Выяснить механизм разделения цепей РНКДНК гетеродуплекса в процессе синтеза РНК. Научная новизна и практическая ценность работы. Настоящая работа позволила идентифицировать в РНКполимеразе РНКсвязывающий сайт, в котором происходят главные взаимодействия, стабилизирующие ЭК. Для локализации этого сайта и исследования его свойств разработан способ получения минимальных элонгационных комплексов, содержащих короткую РНК, с помощью реакции пирофосфоролиза. Подробно изучены свойства минимальных ЭК. Исследована роль длины и нуклеотидного состава РНКДНК гетеродуплекса в стабильности ЭК. Впервые выполнены эксперименты по изучению влияния ДНК дуплекса позади транскрипционного пузыря на свойства ЭК. Показано, что именно белок разрушает РНКДНК гетеродуплекс и направляет РНК в канал выхода. Выявлена дестабилизирующая роль асубъединицы на стадии инициации синтеза РНК. Методом аффинной модификации идентифицированы участки фермента, образующие РНКсвязывающий сайт, а также подробно картированы контакты бконца последовательно удлиняющейся РНК с 3 и Зсубъединицами РНКполимеразы. ЭК. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 6 страницах машинописного текста и содержит рисунков. Библиография включает в себя 8 названий, в том числе 2 русских и 6 иностранных. ГЛАВА 1. Настоящий обзор посвящен рассмотрению всех существующих на сегодняшний день структурнофункциональных моделей элонгационного комплекса. Общие сведения о структуре РНКполимеразы . РНКполимераза . i . соответственно Ii, . . . . Для специфичного связывания с промоторами и инициации транскрипции необходим голофермент комплекс корфермента с одной из нескольких стсубъединиц для большинства промоторов это ст с молекулярной массой ,2 i . . i . . Транскрипционный цикл разделяют на три стадии. Первая стадия начинается с присоединения стсубъединицы к корферменту, т. . . i . Затем последовательно происходят специфичное узнавание промотора . i . . ii , образование открытого промоторного комплекса i .