Рецептор фузикокцина в плазматических мембранах высших растений

• Автор: Бабаков, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 47 с.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время в исследованиях молекулярных механизмов гормональной регуляции в растениях проблема передачи регуляторного сигнала (signal transduction) начинает занимать одно из центральных мест. Определяется это двумя обстоятельствами, во-первых, для таких фитогормонов как ауксин, этилен, а также для фузикокцииа обнаружены гормюн-связывающие белки и установлена их локализация в мембранах, во-вторых., в растениях обнаружены G-белки, Са2"- зависимая протеинкиназа, фосфатидилинозитолтрифос-фат - все те компоненты, которые участвуют в передаче гормонального сигнала в клетках животных. Эти данные указывают на вероятную универсальность механизмов трансмембранного прохождения гормональных сигналов у животных и растений. Такое предположение подтверждается данными о механизме действия в растениях этилена, для которого в плазматических мембранах растений обнаружен рецептор, относящийся по своей структуре к двукомпо-нентным регуляторам и связанный функционально в клетке с цепочкой протеинкиназ (МАП-
каскад), по которой сигнал с поверхности клетки достигает ядра. Однако, до сих пор для боль-
шинства из известных фитогормонов остается неясным, что происходит в растениях после взаимодействия фитогормонов со своим рецептором. Типичным соединением мембранного действия можно считать фузикокцин. Фузикокцин был выделен и очищен в 1964 году из культуральной жидкости гриба Fusicoccum amigdali Del. По своему строению (см.рис.1) он относится к терпеноидам - агликоном в виде своеобразной трициклической структуры, соединенным с глюкозой с изопреновой группой. Было установлено, что он стимулирует открывание устьиц, рост растяжением, прорастание семян, индуцирует корнеобразование, а также обладает антистрессовой активностью. На физиологическом уровне действие фузикокцииа выражается в усилении транспорта ионов и метаболитов в клетки высших растений, связанном вероятно с активацией ЕГ-АТФазы
' .веских мембран [Мале, 1979]. В растениях были обнаружены белки, специфически
• чющие фузикокцин с высоким сродством (Кц = 1-5 нМ), и показано, что они
ск условных сокращений
фузикокцин; ФКР - рецептор фузикокцииа; сШБС - [3Н]дигидрофузикокцин; максимальное количество центров связывания

'СИ,
Рис. 1 Структурная формула
локализованы в плазматических мембранах [Aducci, 1995]. Фузикокдин-связывающие бел присутствуют во всех растениях и составляют несколько процентов от общего белка плазма' ческих мембран- Тем не менее, несмотря на их обилие и распространенность среди растен функции фузикокцин-связывающих белков оставались неясными. Параллельно с Ф связывающими белками в растениях были обнаружены фузикокцин А и вещества близкой к і му структуры, и возник вопрос, можно ли считать фузикокцин фитогормоном, и если да, то я он регулирует и как это регулирование связано с онтогенезом растений [Муромцев, 1996].
Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось установить структури организацию рецептора ФК, исследовать закономерности преобразования гормонального ci нала в растениях на примере рецепции фузикокцииа и на основе полученных результат сделать выводы о роли рецепторов фузикокцииа в онтогенезе растений.
Для реализации этой цели были вьшолнены следующие исследования:
1) проверка потенциальных эффекторов в плазматических мембранах доя рецепторов фузикс цина;
2) сравнение биологической активности фузикокцииа и его аналогов с параметрами их связки гтя с рецепторами, локализованными на плазматических мембранах;
3) идентификация в растениях ГТФ-связывающих белков, локализация, очистка и выяснение участия в активации ЇҐ-АТФазы фузикокцином;
4) исследование участия протеинкиназ в механизме активации ЇҐ-АТФазы фузикокцином;
5) исследование организация рецептора фузикокцииа;
6) изучение реакции рецепторов ФК на различные внешние воздействия.
Научная новизна. В плазматических мембранах высших растениях обнаружены ГТ< связывающие белки. Показано их разнообразие путем разделения солюбилизированного прег рата мембран на фракции и измерения их кинетических параметров связывания с негидрол зуемым аналогом ГТФ - Gpp(NH)p. Один из G-белков выделен и установлена его субъединица структура. Исследовано участие G-белков, протеинкиназ и протеинфосфатаз при активации ф зикокцином Н+-АТФазы и полученные данные свидетельствуют в пользу прямого взаимодейс вия между ФКР и РГ-АТФазой при активации последней ФК без участия протеинкиназ, прот инфосфатаз и G-белков. Эти же данные позволили предположить, что во взаимодействии меж ФКР и ЬҐ-АТФазой существенную роль играет их состояние фосфорштарования/ дефосфорнл рования.
На плазматических мембранах из корней кукурузы, в протопластах из мезофилла и зам кающих клеток устьиц Vicia faba, а также го суспензионной культуры сахарной свеклы (Snj beet) обнаружено два типа ФК-связывающих сайтов, различающихся между собой по аффинь
туре доминировала точка зрения, по которой ФК-связывающий центр локализован на наружной поверхности мембраны (Adueci et а]. 1995), однако в самое недавнее время показано, что это не так. Во-первых, ФК в мембране связывает димер белков 14-3-3, белки 14-3-3 гидрофильны, не имеют гидрофобных доменов и, следовательно, не являются интегральными мембранными белками; во-вторых, оказалось, что ФК-рецептор более чувствителен к протеолизу с внутренней поверхности плазмалеммы (Oecking et al. 1997), в-третьих, белки 14-3-3 взаимодействуют., с С-концевым доменом Н+-АТФазы (Oecking et al. 1997; Jabn et al. 1997, Aducci et al. 1998), который локализован в цитоплазме (Senano, 1989). Неполное блокирование связывания ФК с протопластами а-маннозидазой также находится в соответствии с предполагаемой в последнее время локализацией центра связывания ФК с внутренней поверхности плазматических мембран, а само ее действие и действие проверенных нами протеаз указывают на лабильность ФК-рецепторного комплекса.
Белки 14-3-3 узнают в своих белках-мишенях специфическую короткую аминокислотную последовательность с фосфорилироваяяым серином RSXpSXP (Muslin et al, 1996), которая присутствует в 14-3-3 связывающих белках растений и животных (Aitken, 1996). Среди белков животных наиболее известны RAF-киназа, фосфатаза Cdc 25, тирозин и триптофан гидроксилазы и др. В растениях это нитрат редуктаза, аскорбат пероксидаза и калий выводящий канал КСО!. Дефосфорилнрование серина приводит к ослаблению взаимодействия между димером белков 14-3-3 и белками-мишенями, что выражается в увеличении константы диссоциации этого комплекса (Muslin et al, 1966).
Молекулярная масса функциональной единицы (рецептор, фермент и т.д.), входящей в белковый комплекс, и измеряемая методом радиационной инактивации, зависит от ее взаимодействия с окружающими ее белками: если это взаимодействие сильное, то белковый комплекс ведет себя при радиационной инактивации как единая молекула. Поэтому, сопоставляя молекулярные массы высоко- и низкоаффинных рецепторов, измеренные в данной работе, с известными физико-химическими данными о свойствах белков 14-3-3, можно предполагать, что различие в аффинности ФКР обусловлено различной эффективностью взаимодействия белков 14-3-3 со своими мишенями. Например, высокая аффинность имеет место, когда серии в узнающем мотиве белка-мишени фосфорилировав, низкая аффинность - когда дефосфорилирован. В схеме, представленной на рис. 14, учтены молекулярные массы рецепторов и доступность для гидролитических ферментов с наружной стороны протопластов. Различие во взаимодействии между димером 14-3-3 и гликопротеином отражено на схеме в виде разной площади контакта между ними. Чтобы не перегружать схему, на рис.14 не показана КГ-АТФаза, которая, видимо, присутствует во всех тинах рецепторов. Помимо Н+-АТФазы или вместе с ней в рецепторе ФК может присутствовать и К+~выводящий канал. Недавно был сиквенирован этот белок, названный КС01