Идентификация и картирование LTR на 19 хромосоме человека и анализ структуры локусов 19 хромосомы человека, содержащих LTR эндогенного ретровируса HERV-K

• Автор: Лаврентьева, Ирина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
I. ИНТЕГРАЛЬНЫЕ КАРТЫ ХРОМОСОМ И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ В ГЕНОМЕ ЧЕЛОВЕКА. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1. ПРИНЦИПЫ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ КАРТ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА
1.1 ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КАРТЫ
1.2. ФИЗИЧЕСКИЕ КАРТЫ
1.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ КАРТЫ
2. МАРКЕРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ
ПОСТРОЕНИЯ КАРТ
2.1. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ STS И EST МАРКЕРОВ
мРНК как источник EST
гяРНК как источник EST
2.2. МЕТОДЫ КАРТИРОВАНИЯ STS/EST
Рестриктные карты
FISH-гибридизация
3. ГЕНОМНЫЕ КЛОНОТЕКИ.
ПОСТРОЕНИЕ КОНТИГОВ
3.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХРОМОСОМНОЙ
МИКРОДИССЕКЦИИ
3.2. КЛОНОТЕКИ ГЕНОМА НА ОСНОВЕ YAC
3.3. КОСМИДНЫЕ КЛОНОТЕКИ ГЕНОМА

3.4. РАДИАЦИОННО-ГИБРИДНОЕ КАРТИРОВАНИЕ
3.5. КАРТА 19-Й ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА
4. ЭНДОГЕННЫЕ РЕТРОВИРУСЫ В СОСТАВЕ ГЕНОМА
4.1. СТРУКТУРА ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ
И ИХ КЛАССИФИКАЦИЯ
4.2. ТРАНСКРИПЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ
ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ
II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. МАТЕРИАЛЫ
2. МЕТОДЫ
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Картирование последовательности, гомологичной длинному концевому повтору эндогенного ретровируса
2. Отбор космид, содержащих полноразмерные ЕТК
3. Картирование ЬТИ на космидах с точностью до
ЕсоМ фрагмента, гибридизацией по методу Саузерна
4. Локализация изучаемых ЬТК относительно
известных картированных генов или кДНК
5. Определение первичной структуры картированных ЬТЦ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
LTR (long terminal repeat) - длинный концевой повтор
HERV (Human Endogenous RetroVirus) - эндогенный ретровирус человека
PCR - полимеразная цепная реакция
RFLP - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
PFGE - электрофорез в пульсирующем электрическом поле
FISH - флуоресцентная гибридизация in situ
YAC - искусственные хромосомы дрожжей
RH - радиационные гибриды
STS - sequence tagged site
EST - expressed sequence tag
kb - килобаза
Mb - мегобаза
и.о. - пар оснований
т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов
ОЕ - оптических единиц
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК - рибонуклеиновая кислота
мРЕЕК - матричная РНК
к ДНК - ДНК копия мРНК
гяРНК - гетерогенно-ядерная PFIK
гякДНК - гетерогенно-ядерная кДНК
Трис/TRIZMA base - трис/оксиметил/аминометан
SSC - sodium chloride/sodium citrate buffer
ЭДТА - этилендиаминотетраацетат
SDS - sodium dodecyl sulfate
ПЭГ - полиэтиденгликоль
ПААТ - полиакриламидный гель
ТЕМЕД - ИДДСЕР-тетраметилэтилендиамин
BSA - бычий сывороточный альбумин
dNTP - 2’-дезоксирибонуклеозидтрифосфат
ddNTP - 2’,3’-дидезоксирибонуклеозид-5’-трифосфат

Создание и, главное, анализ клонотек геномов такой сложности требует огромных затрат энергии и времени. Поэтому, в настоящий момент, ученые стремятся пользоваться едиными эталонными клонотеками. Так на основе pYAC4 вектора с сайтом клонирования EcoRl было создано, по меньшей мере, 6 клонотек генома человека, в настоящее время доступны для мирового сообщества. Названия клонотеки получили от мест, где они были сконструированы [Genome digest, v.l, Nol, 1993]:
Библиотека Средний размер вставки Частота ко-лигирования Число клонов ссылка
St.Louis 275 kb 40-50% 60.000 Brownstein et al., 1989
ICI 350 kb -10% 35.000 Anand et ab, 1989
ICRF 600 kb -25% 16.000 Larin et al., 1991
СЕРН-1 440 kb 30-40% 52.992 Albertsen et al., 1990
СЕРН-2 540 kb 30-40% 17.664 Не опубликована
СЕРН-3 (MegaYAC) 918 kb 30-40% 23.808 Chumakov et al., 1992
Картирование больших регионов вплоть до целых хромосом требует упорядочивания серии перекрывающихся YAC клонов [Chumakov et al., 1992; Nizetic et al., 1994]. YAC клонотеки могут быть скринированы PCR и/или гибридизацией. После выявления всех YAC клонов по выбранным маркерам производится “шагание” и/или создание контига в интересующей зоне хромосом. Для этого используют несколько методов:
а) Alu-PCR - используя праймеры на консервативные части А1и-повтора проводят PCR между двумя Alu расположенными в пределах 1 т.п.н. со всеми YAC-клонами и их дальнейшую перекрестную гибридизацию [Nelson et al, 1989];
б) использование концевых фрагментов YAC - проводят аналогично методу "шагания по хромосоме” используя в качестве