Комплексы молекулярного шаперона GroEL с денатурированными белками

• Автор: Марченков, Виктор Викторович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 132 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Проблема самоорганизации белков.

1.1. Равновесные промежуточные состояния белков.

1.1.1. Равновесное промежуточное состояние белков типа расплавленная глобула

1.1.2. Равновесное промежуточное состояние предшественник

расплавленной глобулы.

1.1.3. Нативноподобные промежуточные состояния

1.2. Кинетические промежуточные состояния белков

1.2.1. Ранние кинетические промежуточные состояния

1.2.2. Кинетическое промежуточное состояние расплавленная глобула
1.2.3. Формирование нативного состояния белка, нативноподобные
кинетические промежуточные состояния белков
Глава 2. Концепция ассистируемой сборки белков. Молекулярные шапероны.
2.1. Шаперонные системы прокариотических и эукариотических клеток.
2.1.1. Семейство малых белков теплового шока бИЭР.
2.1.2. Семейство шаперонов Шр.
2.1.3. Семейство шаперонов НэрбО шаперонины.
2.1.4. Семейство шаперонов НБр
2.1.5. Семейства шаперонов Нзр и НБрЮО.
2.1.6. Прочие шапероны
2.2. Молекулярный шаперон СгоЕЬ.
2.2.1. Структура СгоЕЬ
2.2.2. Взаимодействие СгоЕЬ с ненативными белками.
2.2.3. Лиганды СгоЕЬ
2.2.4. Модели функционирования СгоЕЬ как молекулярного шаперона
Экспериментальная часть.
Глава 3. Материалы и методы.
3.1. Подготовка препаратов и биохимические методы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Выделение и очистка СгоЕЬ и СгоЕБ.
3.1.3. Белковые препараты
3.1.4. Получение флуоресцентномеченых производных белков
3.1.5. Гельэлектрофорез.
3.1.6. Ограниченный трипсинолиз
3.1.7. Определение эстеразной активности карбоангидразы В
3.2. Физикохимические методы исследования.
3.2.1. Спектральные измерения
3.2.2. Определение стехиометрии и констант диссоциации комплексов СгоЕЬ с белковыми мишенями.
3.2.3. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия
3.2.4. Кинетические измерения
Глава 4. Результаты и обсуждение
4.1. Взаимодействие СгоЕЬ с кинетическими промежуточными состояниями сворачивающихся белков.
4.1.1. Влияние СгоЕЬ на кинетику ренатурации белков
4.1.2. Влияние АТФ и АДФ на кинетику ренатурации белков в присутствии СгоЕЬ
4.1.3. Моделирование сворачивания белка в присутствии СгоЕЬ
4.2. Комплексы СгоЕЬ с равновесными промежуточными состояниями
белков.
4.2.1. Денатурация белков в нативных для СгоЕЬ условиях
4.2.2. Влияние внешних условий на формирование комплекса ОгоЕЬ с равновесными промежуточными состояниями белков.
4.2.3. Определение стехиометрических параметров комплексов ОгоЕЬ с денатурированными белками
4.2.4. Определение взаимной локализации связанных белковых мишеней на поверхности ОгоЕЬ
4.2.5. Влияние лигандов ОгоЕЬ на взаимодействие шаперонина с равновесными денатурированными состояниями белков
4.2.6. Влияние белковых субстратов на стабильность и конформацию ОгоЕЬ .
Глава 5. Анализ полученных результатов. Модель сворачивания белка
вне комплекса с ОгоЕЬ.
Заключение
Список литературы


В последнее время внимание исследователей, занимающихся проблемой самоорганизации белков, уделялось исследованию так называемых одностадийных белков белков, сворачивание которых происходит по упрощенной схеме без накопления видимых промежуточных состояний. Это, как правило, не содержащие дисульфидных связей и остатков пролина, относительно просто устроенные небольшие белки. Нативная конформация наименьших из них минибелков включает несколько элементов вторичной структуры и небольшое число третичных взаимодействий. Интерес к такого рода объектам обусловлен в первую очередь простотой их организации и, как следствие, возможностью изучения сочетанием экспериментальных и теоретических подходов. Малые размеры и быстрые кинетики сворачивания минибелков позволили использовать методы молекулярной динамики для расчета конформаций сворачивающихся белков с атомарным уровнем детализации. Полученные результаты показывают, что сворачивание одностадийных белков происходит все же с образованием промежуточных состояний, но их низкая стабильность не позволяет зафиксировать их наличие экспериментально. Наличие промежуточного состояния на пути сворачивания наименьшего из известных на сегодня одностадийных минибелков было недавно показано и экспериментально с помошью метода корреляционной флуоресцентной спектроскопии i . Причем дестабилизация промежуточного состояния минибелка с помощью мутации приводила к существенному замедлению скорости его сворачивания. Помимо того, что наличие промежуточных состояний является универсальным свойством путей сворачивания подавляющего большинства белков, интерес к исследованию промежуточных состояний обусловлен также их участием в широком спектре физиологических процессов, начиная от внутриклеточного и трансмембранного транспорта белков и заканчивая связанными с их неполным сворачиванием заболеваниями. Изза сложности структурных исследований в клетке i viv большинство сведений о промежуточных состояниях белков получены в опытах i vi. В зависимости от условий проведения экспериментов обычно различают равновесные образующиеся в условиях термодинамического равновесия и кинетические формирующиеся в ходе сворачивания или разворачивания полипептидной цепи промежуточные состояния. При всем структурном многообразии глобулярных белков, их трехмерная организация подчиняется ряду общих принципов. В пространственной структуре белка можно выделить несколько уровней, образующихся за счет элементарных взаимодействий между аминокислотными остатками полипептидной цепи, при этм на каждом структурном уровне преобладают взаимодействия определенного типа. Формированию элементов вторичной структуры способствует также объединение гидрофобных аминокислотных остатков в довольно протяженные неполярные участки гидрофобные кластеры, расположенные как правило на одной из сторон аспиралей и 3стрэндов. При слиянии гидрофобных кластеров формируется гидрофобное ядро белковой молекулы, обеспечивающее глобулярность белка и задающее вместе с контактами других типов общий ход топологию полипептидной цепи. И наконец, множественные вандерваальсовые взаимодействия между плотно упакованными боковыми группами аминокислотных остатков завершают образование уникальной жесткой трехмерной структуры глобулярного белка. Плотная упаковка полипептидной цепочки существенно сокращает е флуктуационную внутримолекулярную подвижность и предотвращает доступ воды внутрь молекулы белка, придавая ей устойчивость к внешним воздействиям. Уже давно известно, что под влиянием различных дестабилизирующих факторов молекула белка утрачивает нативную структуру и, как следствие, функциональную активность. Процесс денатурации обычно носит кооперативный характер, то есть при постепенном усилении дестабилизирующего воздействия наблюдается не плавное, а скачкообразное изменение свойств белковых молекул. Соответствующие денатурационныс кривые графики зависимости какоголибо структурного параметра белка от силы денатурирующего воздействия имеют характерную 5образную форму с довольно крутой областью перехода.