Участие хоминг-эндонуклеазы SegC бактериофага Т4 в генетической рекомбинации у Т-четных бактериофагов

• Автор: Грановский, Игорь Эдуардович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 95 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Семейство Тчетные бактериофаги.

1.1.1. Классификация бактериофагов Т4типа

1.1.2. Классические Тчетные бактериофаги.

1.1.3. Явление частичного исключении маркеров у Тчстных фагов.

1.2. Бакгериофаг Т4.

1.2.1. Особенности структуры и развития бактериофага Т4

1.2.2. Рекомбинация у бактериофага Т4. модель рекомбинации.

1.3. Хомингэндонуклеазы как особый класс ферментов.
1.3.1. Общая характеристика хомингэндонуклеаз.
1.3.2. Характеристика отдельных семейств хомингэндонуклеаз
1.3.3. Хомингэндонуклеазы фага Т4.
1.3.4. Молекулярные механизмы хоминга.
1.3.5. Использование хомингэндонуклеаз в научных и нракгических целях
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.2. Материалы
2.1.1. Среды, основные буферы и растворы.
2.1.2. Материалы и реактивы
2.1.3. Штаммы бактерий и бактериофаги
2.1.4. Олигонуклеотиды.
2.1.5. Плазмидные векгора
2.3. Методы исследования
2.2.1. Получение компетентных клеток . i и трансформация.
2.2.2. Получение плазмидной ДНК и определение се концентрации
2.2.3. Получение Тчстных бактериофагов.
2.2.4. Получение фага ХСЕ6.
2.2.5. Очистка Тчегных бактериофагов равновесным центрифугированием в градиенте
2.1.6. Получение геномной ДНК бактериофагов и бактерий.
2.2.6. Полимеразная цепная реакция ПЦР.
2.2.7. Гидролиз ДНК эндонуклеазами и лигирование фрагментов ДНК
2.2.8. Конструирование плазмид и секвемиронаиие ДНК.
2.2.9. Анализ рекомбинантных клонов 2.2 Электрофорез ДИК
2.2 ДНКДНК гибридизации по Саузерну
2.2 Электрофорез белков и определение концентрации белка .
2.2 Экспрессия гена и получение препарата белка .
2.2 Получение экстрактов клеток К i, инфицированных фагом Т4
2.2 Определение эндонуклеаз ной активности ,5
2.2 Определение точек расщепления .
2.2 Получение рекомбинатных бактериофагов
2.2 Скрещивание бактериофагов и анализ потомства
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЕН ФАГА Т4 КОДИРУЕТ ХОМИНГЭНДОНУКЛЕАЗУ .
3.1. Анализ области генов 5 6 у Тчетных бактериофагов
3.2. Ген кодирует сайтспецифическую эндонуклеазу
3.3. Сайт гидролиза эндонуклеазы в фаге 2 находится непосредственно в
сайте ипсерции собственной ОРС
3.4. активен на модифицированной ДНК Тчетных фагов
3.5. Эндонуклеаза инициирует хоминг собственного гена при
скрещивании Т4 и Т2Б
РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ И АНАЛИЗ ИИЦИИУЙ РЕКОМБИНАЦИИ
В г7ЛОКУСЕ Т4
3.6. Создание модели рекомбинации, основанной на внесении сайт
специфического двунитевого разрыва в глокус
3.7. Зависимость ДНРинициируемой рекомбинации от расстояния .
3.8. Сравнение рекомбинации справа и слева от ДНР
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ,
Ген фага Т4 кодирует хомингэндонуклеазу .
БевСинициируемая рекомбинация в глокусе Т4 .
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Не менее интересны хомингэндонуклеазы с точки зрения познания эволюционных механизмов. Как правило, эти ферменты с высокой эффективностью инициируют генетический обмен между близкородственными видами, и, таким образом, участвуют в горизонтальном переносе генетической информации. Бактериофаги, в частности Тчетные, являются удобной моделью для изучения роли хомингэндонуклеаз в эволюции. Так, сравнительно небольшой геном фага Т4 около 9 т. Тчетных фагах они встречаются редко. Считается, что хомингэндонуклеазы ответственны за так называемое явление исключения маркеров преимущественное наследование маркеров Т4 при скрещивании фагов Т4 и Т2. При этом потомство, унаследовавшее маркеры Т2, является практически полностью рекомбинантным. Повидимому, хомингэндонуклеазы могут являться существенным фактором эволюции фагов. Хомингэндонуклсазы могут выступать в роли не только объекта, но и инструмента исследований. В частности, они могут использоваться для изучения механизмов репарации двунитевых разрывов ДНР ДНК. ДР в ДНК могут возникать случайно под действием повреждающих агентов, а также программироваться клеткой например, при перестройке иммуноглобулиновых генов, переключении типа спаривания у дрожжей, хоминге, мейотической рекомбинации. Неспособность реиарировать ДНР приводит к нестабильности генома или гибели клетки. Основной путь репарации ДНР основывается на гомологичной рекомбинации. В классической молекулярной генетике исследования рекомбинации базировались на анализе совокупности случайных рекомбинационных событий. Использование модельной системы с детерминированной точкой ДНР в ДНК значительно упрощает анализ и интерпретацию результатов генетических экспериментов. Использование хомингэндонуклеаз позволяет создать такую систему за счет способности этих ферментов узнавать протяженные редко встречаемые последовательности ДНК. Бактериофаг Т4 представляет собой удобную модель для изучения рекомбинации. Т4, классический объект молекулярной биологии и генетики, является одним из наиболее изученных организмов. У этого фага имеется собственный репликационный ирекомбинационный аппарат, который охарактеризован биохимически. В высокой степени развита генетика Т4. Кроме того, имеет собственные хомингэндонуклеазы, а значит его геном адаптирован к их действию. Пели и задачи исследования. Основная цель данной работы заключалась в изучении способности эндонуклеазы инициировать генетический обмен между Тчетными бактериофагами, а также в разработке на основе эндонуклеазы БейС экспериментальной модели для. Т4. Научная новизна работы. В данной работе описана новая сайтспецифичсская эндонуклеаза , относящаяся к IIсемейству хомингэндонуклеаз. Фермент способен гидролизовать как нсмодифицированную ДНК, так и природную ДНК Тчетных фагов, содержащую гликозилированные остатки гидроксиметилцитозина. Предпочтительный сайт гидролиза обнаружен в области генов 56 фага 2, в котором отсутствует ген . Показано, что расщепляет ДНК 2 непосредственно в сайге инсерции собственного гена, что ранее считалось особенностью, присущей исключительно ингроикодируемым эндонуклеазам. Установлено, что в скрещиваниях Т4 и 2 инициирует генетический обмен между этими фагами в области генов 56, что сопровождается генной конверсией в этой области замещением безнуклеазного аллеля 2 на содержащий аллель Т4. Полученные данные свидетельствуют в пользу гипотезы, что именно хомингэндонуклеазы ответственны за явление исключения маркеров, наблюдаемое в скрещиваниях Т4 и 2. Создана модельная система для изучения рекомбинации, инициируемой ДНР втЯлокусе фага Т4. Положение разрыва определяется эндонуклеазой , сайт которой помещен в начало гена . Анализ рекомбинации слева и справа от точки разрыва показал равную и симметричную инициацию рекомбинации каждым концом разорванной хромосомы. Полученные результаты подтверждают основные предсказания i i модели рекомбинации. Научнопрактическая ценность. ДНР.